药用级医用海藻糖的制备方法
1.微生物抽提法 微生物抽提法是以乳酸菌、酵母、霉菌及其它一些含海藻糖的菌体为提取源, 首先通过干燥、改变渗透压等方法处理菌体, 使其体内积累更多的海藻糖, 然后经过乙醇等有机溶剂抽提、精制, 从而得到较高度的海藻糖晶体。这是传统的海藻糖生产方法, 由于酵母中海藻糖含量较高, 可达细胞干重的20 , 通常以酵母提取为主
2.发酵法 发酵法是在一定的基质上培养微生物, 通过微生物发酵生产海藻糖, 再从发酵液中提取精制而成, 其中能利用基质发酵生产海藻糖的微生物包括节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、诺卡氏菌属、丝核菌属、微球菌属等。一般先通过诱变、细胞融合或基因重组选育产海藻糖高的菌株, 然后采用高浓度的培养基及高渗发酵, 并在发酵结束前让菌体/ 饥饿02~ 3h, 从而得到含海藻糖较高的培养物。该方法的缺点是转化率低, 发酵液成分复杂, 海藻糖的提取、精制困难, 因而研究运用先进的生化分离技术, 提高转化率和度, 对于绛低生产成本, 促进推广应用重要。
3.酶转化法 酶转化法是采用葡萄糖、麦芽糖或淀粉等为底物, 通过与海藻糖合成有关的酶的作用转化成海藻糖。根据其作用底物, 主要分为葡萄糖、麦芽糖、淀粉为底物三种生产方法。 (1)以葡萄糖为底物 人们在研究细菌、真菌和植物体内海藻糖的生物合成途径时发现, 在生物体中广泛存在的一条海藻糖合成途径是利用海藻糖- 6-磷酸合成酶( EC21411115) 和海藻糖- 6-磷酸磷酸酯酶( EC31113112) 催化葡萄糖生成海藻糖, 其反应式为: 图1为以葡萄糖为底物合成海藻糖的反应式 2.以麦芽糖为底物 以麦芽糖为底物的酶转化法主要有两种: （1）由麦芽糖生物合成海藻糖的途径: 图2为以麦芽糖为底物合成海藻糖的反应式 该法具有较高的特异性和快速温和等特点, 但反应需要高能物质UDP 或高浓度磷酸盐, 而且磷酸化酶极不稳定, 转化率只有60 , 难于实现大规模的工业化生产; （2）在一些非常见细菌, 如脂肪杆菌和某些耐热菌中发现一种海藻糖合成酶(trehalosesynthase), 它能将A,A-1,4-麦芽糖在分子内重组成 A,A-1, 1-海藻糖。该酶具有较严格的底物一性, 只作用于麦芽糖生成海藻糖及从海藻糖生成麦芽糖, 前者的反应明显优于后者。 3.以淀粉为底物 以淀粉为底物生产海藻糖也有两条途径: 条途径是利用葡萄糖基转移酶(glycosyltransfer GTase) 和淀粉酶(amylase) 将淀粉转化成海藻糖, 转化率可达8115, 这类酶广泛存在于硫化叶菌科中, 种酶是分子内转糖基酶, 将麦芽寡糖水解产生的葡糖基转移到麦芽寡糖还原末端葡糖基C1-OH位置, 产生A,A- 1, 1-葡糖基海藻糖; 淀粉酶水解葡糖基海藻糖生成海藻糖和麦芽寡糖, 该酶仅切割各种葡糖基海藻糖中与海藻糖相邻的A, A- 1, 4-糖苷键, 是一种新型A-淀粉酶。这两种酶热稳定性好, 淀粉价格便宜, 可望成为工业生产海藻糖的新途径。 第二条途径是通过存在于节杆菌Arthrobactersp.Q36以及微黄短杆菌Brevibacterium helvolum,Micrococcus roseus, Sulfolobusacidicaldarium等菌中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl- trehalosesynthase, MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl-trehalose trehalohydrolase, MTHase)的协同作用, 将一定链长的链淀粉转化为海藻糖。麦芽寡糖基海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶, 催化麦芽寡糖(淀粉液化液) 还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的A, A-1, 4-葡萄糖苷键转化成A,A-1, 1-葡萄糖苷键, 生成麦芽寡糖基海藻糖; 麦芽寡糖基海藻糖水解酶一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的A, A-1, 4-糖苷键, 以上两种酶联合作用, 每次从麦芽寡糖生成海藻糖和少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖。
4.基因重组法 基因重组法包括两个方面: 一是利用工程微生物和酶工程改进海藻糖生产, 提高产量, 降低成本;二是利用与合成海藻糖相关的基因构建具有抗逆性的转基因植物。Kim等克隆了非病原菌Brevibacterium helvolum中麦芽寡糖基海藻糖合成酶(BvMTS)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(BvMTH)的基因, 并将两者重组成新基因BvMTSH, 转入大肠杆菌中表达, 表达出的重组蛋白可的将可溶性淀粉转化成海藻糖。 5.化学合成法 海藻糖的化学合成主要是在2，3，4，6—四乙配基—D—葡萄糖和3，4，6—三乙酰—1.2 —脱水—D—葡萄糖之间产生环氧乙烷加成反应。在后一种化合物浓缩过程中也有海藻糖生成。然而海藻糖的化学合成具有较多的缺点，其中主要一点是产率低，分离困难， 至今还处于研究阶段。
药用级医用海藻糖的制备方法
