NAT MED：绘制肿瘤细胞系代谢图谱

1从培养的CCLE细胞系中提取代谢产物

体外培养20种主要癌症类型的928个癌细胞系，用于124种极性代谢物和101种脂类的代谢组学分析(图1a)。使用层次聚类来评估细胞系之间的代谢相似性。两个主要的聚类与造血系和非造血系有很强的相关性，表明这两组的主要代谢是有差异的(p<1×10−10,Fisher’s确切检验)。为了进一步量化代谢物水平(y)与主要癌症谱系(X)的关系程度，采用线性回归模型进行分析。结果表明，225个代谢物中有148个的谱系效应(定义为r²)大于0.1，表明这些代谢物中至少有10%的跨细胞系代谢物水平差异与谱系相关。同时评估了主要癌症谱系中每种代谢物的平均丰度表明不同肿瘤细胞系代谢谱图存在差异。例如，磷酸肌酸在食道细胞系中积累，而在肾脏或造血系中不积累，相比之下，1-甲基烟酰胺在大多数肾脏和胸膜细胞系中含量丰富，但在许多其他谱系中含量较低。

2代谢物与遗传特征的关系

除了谱系外，癌症中的遗传或表观遗传事件也可能改变细胞代谢。为了识别可能由遗传差异引起的代谢变异，我们构建了一个包含705个基因突变和61个扩增/缺失的遗传特征矩阵。应用线性回归模型寻找这些遗传特征和代谢物水平之间的联系(图1c)。遗传特征通过与每个代谢物的相关性进行评分，并按统计学意义的顺序进行比较。有趣的是，我们发现机械相关特征往往与异常代谢物水平具有很强的相关性。下面将讨论所选的示例。

首先，无偏比较结果显示，对于2-羟基戊二酸盐(2HG)来讲，IDH1热点错义突变是首要的预测遗传特征(图1d)。具有这种代谢物异常积累的细胞系大多是IDH1/IDH2突变体(图1e)，与已有报导相符。值得注意的是,虽然CCLE中并没有已知的肾细胞癌(RCC)株系有IDH1 / IDH2突变,其他株系效应分析表明，RCC株系中平均2HG含量比其他株系中多三倍，这与已有研究结果相吻合。

总而言之，通过代谢物和各种遗传特征之间的无偏关联分析，证实了先前发现的将致癌因子变化(如IDH1/KEAP1/ME2)与异常代谢物相关。

3 DNA甲基化调节代谢物丰度

接下来，我们检测DNA甲基化并评估其与代谢物水平的关系。2114个基因的mRNA转录本与其启动子CpG甲基化水平显著相关。相关系统分析揭示与潜在的代谢失调相关的数量惊人的特异性改变(图2a)。这些观察结果可分为两类：

1、DNA高甲基化似乎通过抑制某些代谢物降解途径来影响代谢物水平，例如，SLC25A20的甲基化与长链类酰基肉碱(如油基肉碱)的积累具有很强的相关性(图2b)。SLC25A20，也被称为肉碱/酰基肉碱转位酶，使酰基肉碱通过线粒体内膜进行脂肪酸氧化。SLC25A20高甲基化与标记的mRNA转录减少相关(图2c), 伴随着14、16或18个碳的酰基链的酰基肉碱类物质显著升高 (图2 d-g), 但与其他具有较短或较长的酰基链的酰基肉碱没有关系，这表明在这些细胞系中存在一种不寻常的脂肪酸分解代谢缺陷。

2、DNA高甲基化似乎通过限制生物合成途径的成分来调节代谢水平。例如，脯氨酸水平的降低与PYCR1的高甲基化有关，PYCR1是一种将吡咯啉-5-羧酸盐转化为脯氨酸的酶(图2h，i)。此外，丙氨酸水平的降低与GPT2的高甲基化有关，GPT2可以通过转胺作用合成丙氨酸

4 代谢物依赖关系分析 

长期以来，人们一直希望利用失调的癌症代谢状态进行治疗。为此，我们试图将代谢变化与DepMap CRISPR-Cas9敲除数据集揭示的癌症缺陷联系起来，在该数据集中，483个CCLE细胞系已经通过针对~17,000个基因的~74k sgRNAs文库进行了筛选。利用CERES评分来总结基因水平依赖性(较小的值表示对基因敲除更敏感)，然后就代谢物的变化询问每个基因水平依赖性。这一无偏的代谢依赖相关分析表明，在癌细胞株中观察到的不同代谢表型与不同的基因依赖相关，因此具有潜在的治疗靶点(图3a)。首先，氧化还原代谢物(包括GSH、GSSG和NADP+)的异常积累(部分归因于KEAP1突变，见上述分析)与NFE2L2 (NRF2)敲除敏感性增加有关，NFE2L2是一种参与抗氧化反应的转录激活因子(图3b-d)。值得注意的是，依赖关系zui强的是 SLC33A1(图3b-d)，这是一种乙酰辅酶a转运体，其在氧化还原稳态中的作用目前尚不清楚。同时发现较低天冬酰胺水平的细胞更依赖于其合成酶(ASNS)和EIF2AK4 (GCN2，参与氨基酸饥饿反应)(图3e)。此外，我们还观察到一个有趣的关联，涉及两个不同的甘油三酯(TAG)簇(图3a)。其中一个簇包含多不饱和标签种类（多于4个C=C），另一个簇包含较少不饱和标签种类及单不饱和脂肪酸酰基(MUFA)(图3a)。为了区分富含这两类物质的癌细胞系，我们将其标记为高多不饱和脂肪酰基 (PUFA^high, n=315)或低多不饱和脂肪酰基(PUFA^low, n=325)，排除了那些没有明显脂质不饱和差异的细胞系(图3f)。其他脂类如磷脂酰胆碱(PC，图3g)和胆固醇酯(CE，图3h)也存在这种不饱和差异。为了验证这种*的脂质利用模式是否与靶标依赖相关，对比CERES评分，发现PUFA^high细胞系对GPX4敲除敏感(图3i)，GPX4敲除介导了过氧化PUFA的解毒作用。相比之下，PUFA^low细胞系对合成MUFA的CTNNB1或SCD的缺失很敏感(图3i)。总之，这些无偏关联分析表明，体外培养的癌细胞具有显著的脂类差异，可以根据PUFA分类选择性靶向分析。

5 CCLE细胞系的表型分析

如上所述，较低的天冬酰胺水平与较高的天冬酰胺合成酶(ASNS)缺失敏感性密切相关(图3e)。当培养基中天门冬酰胺缺失时，ASNS基因的下调明显阻碍了细胞的增殖。考虑到一些具有ASNS启动子高甲基化的CCLE细胞系，即使存在其转录激活因子ATF4，其ASNS表达也异常低(Fig.4a), 因此推测内在甲基化依赖型基因抑制可能通过特定的营养剥夺来选择性靶向目标基因。为了探索这个问题，使用有24个核苷酸barcodes标记的544种的CCLE细胞株(图4b)在氨基酸组成明确的条件种培养，并在处理6天后使用barcode高通量测序方法评估细胞活力。我们发现，当在限制天冬酰胺条件下生长时，那些异常低表达的ASNS被选择性地耗尽(图4 c)。类似的，发现低表达ASS1和GLUL(启动子区域甲基化影响)标记的细胞表达较低，它们对精氨酸供应减少更敏感，对谷氨酰胺也更敏感 (图4d, e)。综上所述，这些例子表明，DNA高甲基化影响了对营养有效性的依赖，例如癌细胞亚群中的天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺营养缺乏。

6 扩展天冬酰胺酶的治疗作用

前面的表型现象促使我们探索天冬酰胺酶的潜在治疗价值超出急性淋巴细胞白血病(ALL)的范围。我们证实ASNS高甲基化的细胞也缺乏蛋白表达(图5a-c)，并且在体外对天冬酰胺酶非具有高度敏感性 (图5d)。为了确定该依赖性是否也存在于体内，将7*10⁶的2313287 (ASNS^high)或SNU719 (ASNS^low)细胞分别植入裸鼠的两侧。当肿瘤体积达到100-200 mm³左右时，用天冬酰胺酶腹腔注射(3000单位/kg/注射，每周5次)或空白对照的方法对小鼠进行治疗，并在3周内监测肿瘤的生长情况。发现SNU719肿瘤的生长明显下降，而2313287肿瘤的生长几乎没有下降(图5e)。还发现，在植入和治疗这些异种移植肿瘤的过程中，ASNS的高甲基化和表达丢失得以维持(图5f)。这些数据也表明ASNS免疫组化可能被应用于天冬酰胺酶试验的患者分类和选择。同时检测癌症基因组图谱(TCGA)中胃癌和肝癌的DNA甲基化，发现它与肿瘤样本中ASNS表达的降低显著相关(图5g)。总之，这些结果表明，天冬酰胺酶可以抑制肿瘤细胞系的特定亚群的生长，同时在体内和体外都可以抑制ASNS的表达。

7 CCLE中犬尿氨酸代谢谱图

除了分析具有营养价值的代谢物外，我们还探索了包括犬尿氨酸在内的信号代谢物的模式。犬尿氨酸由色氨酸分解代谢产生，通过芳基烃类受体(AHR)发挥免疫抑制作用，抑制效应T细胞增殖，促进调节性T细胞生成。这些发现导致了针对犬尿氨酸通路的IDO1抑制剂联合PD1阻断剂的临床试验。在CCLE中，我们观察到跨越多个癌症类型的三个数量级的细胞内犬尿氨酸浓度 (图6a)。我们发现，在发现和验证的细胞系中，细胞内较高的犬尿氨酸水平与培养基中分泌更多的犬尿氨酸密切相关 (图6b)。这些数据表明，具有较高细胞内犬尿氨酸浓度的细胞系也在积极地将其分泌到细胞外空间。通过将mRNA转录本(n=18,205)与犬尿氨酸水平相关联，我们发现IDO1、IDO2和TDO是与犬尿氨酸水平显著相关的zui热门的三个位点(图6c)。有趣的是，我们在IDO1/2或TDO mRNA水平高的细胞系中观察到丰富的细胞内犬尿氨酸(图6d)。根据癌细胞IDO (IDO1为主要形式)和TDO的表达，我们将全尿酸含量高的癌细胞两类，约有三分之一的癌细胞同时表达IDO1和TDO，其余的由IDO1或TDO驱动(图6e)。在TCGA的不同肿瘤样本中也可以观察到这种差异表达模式(图6f)。这表明，癌细胞可能使用酶或潜在的两者都产生犬尿氨酸。接下来，我们研究了IDO1选择性抑制剂epacadostat是否在这些不同的环境中有效阻断犬尿氨酸的分泌。为了在体外验证这一点，我们在三个有代表性的细胞系中研究了epacadostat对犬尿氨酸分泌的抑制作用。我们发现epacadostat*抑制NCIH596 (IDO1^high)的犬尿氨酸分泌，导致IGR39 (IDO1^high + TDO^high)的犬尿氨酸分泌大量减少，而对JHH7 (TDO^high)的影响很小(图6g)。因此，这些将高犬尿氨酸与IDO1或TDO mRNA表达联系起来的数据表明，选择性的IDO1抑制可能只在这些肿瘤的一个亚群中起作用，并且可能进一步受到TDO介导的逃逸。zui近，关于epacadostat与抗PD-1抗体pembrolizumab联合应用于未被选择的转移性黑素瘤患者的III期阴性数据被报道，我们的数据提出了这样一种可能性，即选择肿瘤中犬尿氨酸含量增加的患者，同时了解哪些酶正在产生犬尿氨酸，这可能对进一步开发IDO/TDO抑制剂至关重要。