动脉粥样硬化是一种以动脉壁增厚、慢性炎症和内皮功能失调为特征的主要心血管疾病。病理性刺激引发内皮功能障碍，导致血流异常，可能引发动脉血栓形成和终末器官缺血。这些事件发生在动脉的粥样硬化易发区域，其中内皮暴露于受干扰的血流或振荡剪切应力（OSS），如在分叉处和弯曲处。
剪切应力已被证明在调节内皮细胞表面机械敏感受体的激活中起关键作用。在暴露于某些类型的剪切应力（例如层流和高剪切应力）的区域中，内皮细胞表现出动脉粥样硬化保护特性，而暴露于扰流或 OSS 下的内皮细胞表现出内皮细胞表型的转变，从而导致炎症级联，以及免疫细胞与内皮的粘附。
黄酮醇是一类与植物色素沉着相关的生物类黄酮，已被证明具有显著的抗氧化作用并调节细胞信号通路。胡桃苷是最近发现的一种黄酮醇化合物，它来源于普通核桃树，还来源于一种低洼的一年生草本植物萹蓄。研究表明胡桃苷具有重要的抗氧化、抗炎和抗癌作用，但目前调查胡桃苷在动脉粥样硬化中的作用的研究还很少。
在此项研究中，郑州人民医院心脏大血管外科、河南省人民医院、阜外华中心血管病医院的课题组评估了胡桃苷对暴露于 OSS 的人主动脉内皮细胞的各种潜在的动脉粥样硬化保护作用。
胡桃苷减少 OSS 诱导的氧化应激
OSS 诱导的氧化应激是导致内皮功能障碍的主要因素，内皮功能障碍是动脉粥样硬化和心血管疾病的最早预测因子之一。NADPH 氧化酶-2（NOX-2）已被证明有助于 ROS 的产生，动脉粥样硬化中的氧化应激和 NOX-2 的抑制可减少内皮功能障碍。
实验首先发现，暴露于 OSS 使 NOX-2 在 mRNA 和蛋白质水平上的表达分别增加了 3.9 倍和 3.3 倍。然而，用 2.5 和 5 µM 胡桃苷处理以剂量依赖性方式将 NOX-2 表达降低至 mRNA 水平的 2.5 和 1.4 倍，以及蛋白质水平的 2.2 和 1.5 倍（图1）。接下来评估了胡桃苷对 OSS 诱导的 ROS 产生的影响。DHE 染色结果显示，OSS 将 ROS 水平提高到 3.5 倍，而胡桃苷以剂量依赖性方式将 ROS 生成降低到仅 2.2 和 1.5 倍。
图1 胡桃苷降低了人主动脉内皮细胞（HAECs）中振荡剪切应力（OSS）诱导的 NOX-2 表达。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情况下，将细胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小时。（A）NOX-2 的 mRNA 水平（B）NOX-2 的蛋白质水平
胡桃苷抑制 OSS 诱导的促炎细胞因子表达
为了评估胡桃苷对 OSS 诱导的氧化应激的影响，实验使用实时 PCR 和 ELISA 分析测量了 IL-1β、MCP-1 和 HMGB1 的表达水平。
单独使用 OSS 可使 IL-1β 的 mRNA 表达增加 4.4 倍，而 2.5 和 5 µM 胡桃苷将 IL-1β mRNA 表达降低至 2.7 和 1.8 倍（图2 A）。
对于 MCP-1，两种剂量的胡桃苷将 OSS 诱导的 5.7 倍减少到仅 3.4 和 2.5 倍。在蛋白质水平上，OSS 将 IL-1β 和 MCP-1 的表达分别从初始浓度 205.8 和 332.7 pg/ml 增加到 952.5 和 1522.8 pg/ml（图2 B）。两种剂量的胡桃苷分别将 IL-1β 的浓度降低到 658.2 和 512.9 pg/ml，将 MCP-1 的浓度分别降低到 1123.4 和 823.5 pg/ml。
单独的 0.25-5μM 胡桃苷对 HMGB-1 的产生没有任何显著影响，但两种较高剂量的 25 和 50μM 胡桃苷将 HMBG1 的浓度从 276.5 分别增加到 343.1、379.8 pg/mL。OSS 将 HMGB1 的浓度从 262.5 增加到 782.3 pg/ml，胡桃苷以剂量依赖性方式将其降低到仅 523.7 和 309.6 pg/ml。
因此，胡桃苷可能抑制 OSS 诱导的炎症和单核细胞募集。
图2 胡桃苷可降低 HAECs 中由 OSS 诱导的促炎细胞因子的表达。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情况下，将细胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小时。（A）IL-1β 和 MCP-1 的 mRNA 表达；（B）IL-1β 和 MCP-1 的分泌。
胡桃苷拯救了 eNOS 和 NO 的表达
接下来测量了在有或没有胡桃苷的情况下暴露于 OSS 的 HAECs 中 eNOS 和 NO 的表达水平。OSS 使 eNOS 的 mRNA 表达降低了 61%，但在两种剂量的胡桃苷存在下，eNOS mRNA 表达分别仅降低了 34% 和7%（图3 A）。蛋白质印迹分析所示，OSS 下 eNOS 的蛋白质表达降低了 55% ，但在 2.5 和 5 µM 胡桃苷存在下仅降低了 26% 和 4%（图3 B）。对于 NO 的产生，发现 OSS 将 NO 水平降低了 62%，而 2.5 µM 胡桃苷将使 NO 水平降低到仅21%，而 5 µM 胡桃苷将 NO 水平比基线增加了 8%。因此，胡桃苷对 OSS 诱导的 eNOS 和 NO 表达降低具有有效的保护作用。
图3 胡桃苷恢复了 OSS 诱导的 eNOS 和 NO 的降低。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情况下，将细胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小时。（A）eNOS 的 mRNA；（B）通过蛋白质印迹分析测量的 eNOS 蛋白质水平；（C）NO 浓度。
胡桃苷抑制单核细胞与内皮细胞的粘附
为了确定胡桃苷对 OSS 诱导的单核细胞与内皮细胞附着的影响，实验测量了 VCAM-1 和 E-选择素的表达水平，并量化了 THP-1 单核细胞与 HAECs 的附着。
OSS 分别将 VCAM-1 和 E-选择素的 mRNA 表达增加至 4.1 倍和 4.9 倍（图4 A）。然而，2.5 和 5 µM 胡桃苷将 VCAM-1 的 mRNA 表达降低到 2.5 和 1.6 倍，将 E-选择素的 mRNA 表达降低到 3.3 和 2.1 倍。OSS 使 VCAM-1 和 E-选择素的蛋白质表达增加 3.7 和 3.5 倍，但在较小剂量的胡桃苷存在下仅增加 2.5 和 2.3 倍，在大剂量下仅增加了 1.4 和 1.5 倍（图4 B）。在共培养实验中，发现 OSS 使附着的 THP1 单核细胞的数量增加了 3.8 倍，而两个剂量的胡桃苷使其减少到仅 2.2 倍和 1.5 倍。
这些结果表明胡桃苷具有预防动脉粥样硬化病变形成的潜在重要能力。
图4 胡桃苷降低了 OSS 诱导的 VCAM-1 和 E-选择素的表达。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情况下，将细胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小时。（A）VCAM-1 和 E-选择素的 mRNA 水平；（B）VCAM-1 和 E-选择素的蛋白质水平。
胡桃素可挽救 OSS 诱导的 KLF2 表达降低
作为一种重要的动脉粥样硬化保护因子，增强 KLF2 表达是一个有希望的治疗靶点。实验发现，OSS 将 KLF2 的 mRNA 表达水平降低了54%，而两种剂量的胡桃苷将其挽救为 28% 和 4%。OSS 使 KLF2 的蛋白质表达降低了 58%，但在 2.5 和 5 μM 胡桃苷存在下仅降低了 31% 和 7%。因此，胡桃苷对 OSS 诱导的 KLF2 表达降低具有有效的剂量依赖性保护作用。
总的来说，该研究结果表明，胡桃苷可以防止各种促动脉粥样硬化的 OSS 诱导的内皮功能障碍。胡桃苷作为动脉粥样硬化血管干预的候选药物具有潜在的意义。
参考文献：Zhao J, Quan X, Xie Z, Zhang L, Ding Z. Juglanin suppresses oscillatory shear stress-induced endothelial dysfunction: An implication in atherosclerosis. Int Immunopharmacol. 2020 Dec;89(Pt B):107048. doi: 10.1016/j.intimp.2020.107048. Epub 2020 Oct 10. PMID: 33049495.
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