标记抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率-西安瑞禧
一般每个抗体可以标记3-5个，标记时，与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，应蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应20倍，也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物。
一、试剂和器材：
1、 标记反应溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）
NaCl 8.77 g ；Na2HPO4·12H2O 32.3g ；NaH2PO4·2H2O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH 7.2，后定容为 1000mL
2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587） ，溶解于95 µl 纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡室温。也可以配置200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃稳定几个月。
由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入纯水。
3、滤管
⑴、Millipore滤管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，残留体积200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的大离心力14000×g）离心10min。
⑵、Millipore滤管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，残留体积80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的大离心力14000×g）离心5 min。
⑶、Amicon Ultra -0.5ml离心滤管（Millipore），效果好，的终浓缩物体积：5-15ul。
二、抗体滤处理
标记前需要应用截留分子量为50kDa 的滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。
具体操作步骤：
1、 于滤柱中加入200μl 标记反应溶液，加入500ug 单克隆抗体，混匀。
2、 4℃，6000rpm，离心2min。弃滤液。
3、于滤柱中加入100μl 标记反应溶液，混匀。4℃，Max 14000×g，2min。
4、 重复步骤2 6到7次。
5、 混匀滤柱中的残留的液体，室温静置1min。
6、 将滤柱反转倒置于一的滤管中，4℃，1000×g，2min，收集滤液。
7、 取50μl PBS于滤柱中混匀，静置1min。
8、 倒置滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml （0.25ml）。
三、标记抗体
1、 计算抗体标记需要用量。
抗体浓度 2 mg/ml时的简要计算：
1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of 10mM NHS-PEG4-Biotin
具体计算方式见附录一（标记计算）
2、 滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。
3、 葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离)：
四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：
（一）、试剂：
1、纯化柱处理液 :100 mmol/L Na0H;
2、纯化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含0.5g NaN3 ，8g NaCl;
3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;
4、标记抗体保护液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。
（二）、凝胶过滤：
方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”
五、标记抗体的保存方法
将“标记抗体保护液（50×）”加入到标记抗体溶液中，使BSA终浓度为0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。
六、数据记录：
抗体浓度： mg/ml 加入抗体体积： µl
标记前抗体体积： µl 加入NHS-PEG4-Biotin体积： µl
纯化柱规格： cm × cm 凝胶体积： ml
加入标记抗体体积： µl
洗脱溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
洗脱液体积 |
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A280 |
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管号 | 5 | 6 | 7 | 8 |
洗脱液体积 |
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A280 |
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管号 | 9 | 10 | 11 | 12 |
洗脱液体积 |
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A280 |
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附录：
一、标记计算：
1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：
Sulfo-NHS-Biotin MW：589
| Sulfo-NHS-Biotin：抗体 |
抗体浓度10-12mg/ml时 | 12 |
抗体浓度4-7mg/ml时 | 16 |
抗体浓度1-3 mg/ml时 | 20 |
抗体浓度0.5mg/ml时 | 50 |
2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：
Sulfo-NHS-Biotin （mg) | PBS（µl) | Sulfo-NHS-Biotin （mg/µl) |
0.56 | 95.1 | 0.00589 |
3、标记计算加入体积计算：
| 计算公式 | 抗体浓度 2 mg/ml时* |
抗体浓度（ mg/ml） |
| 4.5 |
抗体加入量（ml) |
| 0.11 |
抗体加入量（mg) | 抗体浓度×抗体加入量 | 0.495 |
抗体的毫摩尔数（其他蛋白注意分子量） | 抗体加入量/1500000 | 0.0000033 |
需要的活化Biotin量（mmol） | 抗体的毫摩尔数×20 | 0.000066 |
活化Biotin量（mg） | Sulfo-NHS-Biotin量 （毫摩尔）×589 | 0.038874 |
需要10mmol/L 活化Biotin体积（µl） | 活化Biotin量（mg） /活化Biotin浓度（mg/µl) | 6.6 |
西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有：
UV-Tracer Biotin NHS Ester
Biotin-EA -乙二胺
Biotinyl hexylamine
Biotin-PFP 五氟苯酯
Biotin-LC-NHS N-琥珀酰亚氨基6-氨己酸
Biotin-LC; 6-氨基己酸
4-((Biotinoyl)amino)Butyric acid 酰基-4-氨基丁酸
Biotin-HZ 酰肼
LC-(+)-Biotin hydrazide CAS:109276-34-8
Biotin-HPDP cas:129179-83-5
D-Biotinol; D-醇 CAS：53906-36-8
BIOTIN DSHSE CAS:142439-92-7
Biotinyl Cystamine -半胱胺 cas:128915-82-2
Biotin-Dadps-azide
Dethiobiotin 533-48-2
Desthiobiotin NHS Ester CAS:80750-24-9
Biotin-ONP (+)--4-硝基苯酯 33755-53-2
Biotin-L-sulfoxid；亚砜 3376-83-8
Biotin-cadaverin trifluoracetate 288259-39-2
N-Biotinyl Glycine;甘氨酸 160390-90-9
D-甲酯;DL-Biotin methyl ester 60562-11-0
Biotin修饰CdTe量子点
化修饰的聚己内酯(PCL/Biotin)
Biotin-PEG-b-Leu
链霉亲和素化的量子点(streptavidin-QDs)
Prazosin-PEG2000-biotin
(Biotin)表面功能化修饰多壁碳纳米管
Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX
PLL-PEG-Biotin
Biotin-PEG-c(RGDyK)
biotin-HWTX-Ⅰ标记蛛神经虎纹捕鸟蛛-Ⅰ
ssDNA-Biotin-SA-AuNPs复合物
标记的透明质酸(HA-biotin
PAH-Biotin修饰半胱氨酸
Biotin-Ebselen小分子探针
偶联四氨基卟啉
磷酰化偶联壳聚糖
Chol-Dex-Biotin 偶联葡聚糖修饰
DOTA-Biotin偶联大环配体造影
藻胆蛋白标记Phycobiliprotein-Biotin
藻胆蛋白-链霉亲和素(Streptavidin-phycobiliprotein)
偶联物OVA-ZEN-biotin
(Biotin)偶联的多肽zs6
Biotin-DNA偶联物
鸡卵清白蛋白偶联(Biotin-OVA)
辅A-(Coenzyme A-biotin)
FITC标记的转铁蛋白(Tf-FITC)
(biotin)修饰的ddNTP核苷酸
活化的转铁蛋白(Biotin-Tf)
HEMA-biotin-Lys-CD
蛤蚌-偶联物
姜黄素-偶联物
多肽CRGD修饰红膜
偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖
-葡聚糖聚醛偶联物(Chol-Dex-CHO)
BIO修饰阿霉素DOX-biotin
修饰BIOTIN-Drud
CY3/CY5/CY5.5-Biotin修饰荧光染料
Biotin alkyne 773888-45-2
Biotin-PEG4-alkyne 1458576-00-5
Biotin-PEG2-C4-alkyne 1011268-28-2
Biotin-PEG4-amide-Alkyne 1006592-45-5
Dde Biotin-PEG4-alkyne 1802908-00-4
PC Biotin-PEG3-alkyne 1869922-24-6
Diazo Biotin-PEG3-alkyne 1884349-58-9
DADPS Biotin Alykne
Biotin-PEG2-azide 1910803-72-3
Biotin-PEG3-azide 875770-34-6
Biotin-PEG4-azide 1309649-57-7
Biotin-PEG2-C6-azide 1011268-29-3
Biotin-PEG4-Picolyl azide 2222687-71-8
Biotin-SS-azide 1620523-64-9
Dde Biotin-PEG4-azide 1802907-93-2
Dde Biotin-PEG4-Picolyl azide 2055048-42-3
Diazo Biotin-PEG3-azide 1339202-33-3
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以上资料源于西安瑞禧生物科技有限公司
Xi'an ruixi Biological Technology Co;Ltd
