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不停歇的蛋白质组学分析:全新一代Exploris 240质谱

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2020/6/9 15:15:19

不停歇的蛋白质组学分析:全新一代Exploris 240质谱

 

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引言

赛默飞是蛋白质组学领域的ling导者,每一款产品一经推出即成为万众瞩目的焦点。今年的质谱年会上赛默飞重磅推出智能化Exploris系列质谱—— Orbitrap Exploris 240。这款新产品的到来,进一步拓展了赛默飞超高分辨质谱在蛋白质组学领域的产品线,同时也为我们带来全新的蛋白质组学体验。让我们一起领略Orbitrap Exploris 240质谱的丰富多彩的蛋白质组学应用吧。

 

一. Exploris 240的性能参数和蛋白质组学应用概览

 

Exploris 240的性能特点

Exploris 240是四极杆和超高场Orbitrap的串联质谱,分辨率可达240,000,扫描速度高达22Hz,在蛋白质分析的功能上支持APD(Advanced Peak detection)算法;R 45000用于TMT 11plexTMTpro(16plex)的分析;兼容FAIMS Pro离子淌度接口;支持DDADIAPRMt-SIM多种扫描模式;通过Biopharma option的扩展m/z 至8000用于完整蛋白分析;Easy IC的实时内标校正模式使质量轴稳定在1ppm

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图1. Orbitrap Exploris 240 MS

产品特点

• 超高场 Orbitrap 分析器

• 质量范围 m/z 40-6000

• 质量精度内标 <1ppm,外标 <3ppm,Easy IC 实时内标校正

• 分辨率 > 240,000

• 扫描速度高达 22 Hz

• 扫描模式:FS, t-SIM, DDA TopN, DDA TopTime, DIA, t-MS2 (PRM), AIF

• 高级扫描模式:AcquireX,  APD, TMT @ 45k

• 选配:FAIMS Pro,Biopharma option

 

Exploris 240应用于蛋白质组学分析的设计理念

Exploris 240质谱平台上融合了赛默飞在蛋白质组学积累的技术和工作流程,通过打包的方式呈现给用户。Exploris 240可以开展基于DDA的蛋白质鉴定和定量流程,基于DIA的定量流程,TMT的定量流程,基于PRM的靶向蛋白定量流程,这些工作流程都以方法模板的形式内嵌在质谱方法中,操作人员只需要针对特定的实验设计选择对应的方法即可。同时Exploris 240延续了Exploris 480稳定的硬件设计,可以无间断分析临床大队列样本

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图2. Orbitrap Exploris 240 质谱仪-先的性能,多功能性和易用性

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二.  Exploris 240蛋白质组学工作流程

 

深度、快速蛋白质组覆盖

赛默飞组学应用开发团队对不加FAIMS Pro的4台Exploris 240进行蛋白鉴定数目测试(1µg Hela酶切肽段,60分钟梯度),4台Exploris 240蛋白鉴定数目均在5300个蛋白以上(图3),显示出仪器间具有很好的重现性。

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图3. Exploris 240在1 µg Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色谱柱,不加FAIMS Pro的情况下肽段和蛋白鉴定数目

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Exploris 240加载了FAIMS Pro 后,蛋白质组的覆盖深度进一步提高,蛋白鉴定数目可提高25%1小时梯度,1µg Hela酶切肽段中蛋白鉴定数超过了6000个蛋白。

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图4. Exploris 240在1 µg Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色谱柱,不加装FAIMS Pro,FAIMS单电压CV (-45V), FAIMS双电压 (-50/70V)的条件下肽段和蛋白鉴定数目

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接着对不同梯度的200ng Hela进行蛋白鉴定深度测试,30分钟可鉴定3432个蛋白,60分钟可鉴定5064个蛋白,90分钟可鉴定5986个蛋白,120分钟可鉴定6335个蛋白。

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图5.Exploris 240在200ng Hela酶切肽段, 不同色谱梯度, Top 20 method,Ionopticks 625px column,FAIMS双电压(-50/70V)的条件下肽段和蛋白鉴定数目

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继续对不同浓度的Hela酶切肽段进行测试,Hela的浓度范围从10ng到1000ng,跨越3个数量级,在每个浓度下Exploris 240均能获得惊人的蛋白鉴定数。即使在10ng低浓度的上样量的情况下,Exploris 240仍然能够鉴定1600个蛋白

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图6. Exploris 240在不同浓度HeLa digest,90min色谱梯度,FAIMS Pro 2 CV (-50/-70), Ionopticks 625px column, Proteome Discoverer™ 2.4 Mspep谱图库检索,1%FDR的肽段和蛋白鉴定数目

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需要注意的是,FAIMS Pro在多肽分离上具有*正交性,如图7所示,200ng Hela 30min梯度-50V和-70V鉴定到的肽段中只有3%的肽段是重复鉴定的。

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图7. 200ng Hela, 30min梯度CV -50V和-70V的肽段的Overlap图,只有3%肽段重复鉴定

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此外,针对很多蛋白质科学平台老师日常工作中常见的IP蛋白鉴定样品,Exploris 240可以将IP样品分析的时间缩短至30分钟。免疫富集AKT/mTOR通路中12个蛋白的样品在30分钟梯度内就可以鉴定到超过1600个蛋白,大大缩短了分析的周期。

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图8. 高通量IP蛋白鉴定。免疫富集 AKT/mTOR通路的12个蛋白,进行蛋白酶切,使用15min和30min梯度蛋白质鉴定

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深度、精确蛋白质定量

定量蛋白质组学是蛋白质分析的*手段,Exploris 240可实现非标记定量(图9),DIA定量,TMT定量(图10)和PRM靶标定量(图11)4种模式,满足定量蛋白质组学分析的多种需求。Exploris 240源于Orbitrap的定量技术,定量性能可达amol级别灵敏度,并实现 5个数量级的线性范围。

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图9. Exploris 240非标记定量性能。两种蛋白质混合物的精确非标记定量。酵母蛋白消化液以1:10,1:5,1:2的比例加入到200 ng Pierce HeLa消化液标准品的背景中。在Orbitrap Exploris 240 质谱上对两种蛋白混合物进行分析,然后在Proteome Discoverer™2.4软件中使用Minora feature detector 模块进行LFQ数据处理

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图10. 基于TMT的高准确度定量的可重现性。A) 在带有FAIMS Pro接口的Orbitrap Exploris 240 质谱上使用两种补偿电压(-50和-70 CV),对500ng TMT 11plex 标记的酵母消化标准品进行60分钟梯度的定量分析。该标准样本为用户提供了一个工具,用于不同仪器测量TMT方法的准确性、精密度和蛋白质组深度的考察。B)所示的是FDR卡值为1%以下的蛋白质和多肽的定量数量。C)所有重复的无干扰指数均达到75%。

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图11. Exploris 240准确的PRM定量性能。Pull-down AKT/mTOR通路的12个蛋白,加入AKT/mTOR SureQuant kit轻标和重标肽段,含有30个高纯度的重标和轻标肽段,进行PRM定量分析。83%肽段CV<10%,可达5个数量级的动态范围。

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应用于临床大队列分析

蛋白组大队列分析是很多临床和转化医学实验室的诉求,Exploris 240继承了Exploris 480稳定和易用的硬件设计,真正做到不停歇的蛋白组分析。今年赛默飞精准医学中心开发了快速蛋白质组分析流程,自动化的样品前处理每天可以处理500个样本,高通量的LC-MS分析可以实现60个样品/天的通量。

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图12. 大规模临床队列分析实验流程。自动化的样品前处理酶切方法每天可以处理500个样本,1台Exploris 240可以实现60样品/天的分析速度,分析1000个样品只需要18天的机时。同时不同Exploris 240质谱之间数据结果具有高度一致性,实现多台质谱同时分析。

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Exploris 240可以加配FAIMS Pro离子淌度接口,质谱分析中,FAIMS Pro只选择特定的肽段离子进入质谱,阻挡了很多干扰物离子,大大缩短仪器的维护周期,用户只需要定期对FAIMS Pro进行维护即可,而维护FAIMS Pro只需要短短半个小时的时间。赛默飞应用开发团队比较了在清洗FAIMS Pro前后,TMT标记的蛋白鉴定数目和IFI指数几乎一致,用户无需担心维护FAIMS Pro会导致实验重现性的差异。

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图13. FAIMS Source Pro易于安装和维护,同时支持气相分离,并通过去除污染物提高了仪器的可靠性。在清洗FAIMS Pro前后,蛋白的鉴定数目和共隔离指数一致。

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总结

Exploris 240是赛默飞蛋白质组学领域继Exploris 480之后的又一集大成之作,融合了赛默飞的蛋白质分析技术,将蛋白质组学的应用方法模板化,方便用户使用;同时在蛋白鉴定数,定量性能上有优异的表现,且充分考虑了大队列蛋白质组分析中仪器稳定性的问题可以预见Exploris 240必将成为蛋白质组分析*的主力成员。

 


                                                                                   重磅 6月16日

                                                                                     新品发布会

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