ASMS2020 赛默飞线上预热讲座集锦第三期：蛋白组学新技术与热点
疫情并不能停止分析科学家们技术交流与分享，6月1-12日，质谱界盛会—第68届美国质谱年会，在线上盛大举行。在此之前，赛默飞举办了线上预热讲座，内容涵盖LC-MS新产品，以及蛋白组学、生物制药、代谢组学等应用方向，所有内容现在仍可通过注册进行线上观看。
上一期，与大家分享了Surequant靶标定量新方法，这一期继续与大家分享讲座中涉及的蛋白组学新技术与热点。
Prosit: 组学水平的深度学习谱图预测
传统的质谱搜索引擎在匹配理论与实验谱图（PSM）时，不考虑离子强度、碎裂能量等实验信息。而在DIA方法中，二级谱碎片离子强度以及母离子保留时间对匹配准确性至关重要。来自德国慕尼黑大学的科学家Bernhard Kuster系统介绍了Prosit谱图预测算法。通过对数据库中高质量质谱数据的学习，建立深度学习模型可以很好地预测二级谱图以及保留时间等信息。
通过深度学习对碎片保留时间和离子强度进行准确预测。A, Prosit深度学习机制。B, Prosit用于预测碎片离子强度; C, 碰撞能量校准的碎片强度预测与实际肽段谱图更接近（点击查看大图）
在DDA中用实验谱图与预测谱图进行匹配打分，也可以大大提高对target肽段的检出能力（FDR=1%），据Küster介绍，FDR会低10~100倍。作者在多个实验中验证了Prosit对多肽二级谱以及保留时间的预测准确性，并展示这种预测能力极大地提高了搜索质量，可以使传统的target-decoy搜库方法得到非常大的进步。
Prosit深度学习机制提升DDA数据的解析结果。A, Prosit强度预测提高数据库检索的可信度；B，Prosit可以在宏蛋白质组大数据搜索空间中实现更可靠的鉴定; C，Prosit预测也适用于非胰酶酶切肽段尤其是单电荷肽段，提升对HLA peptide的解析结果。（点击查看大图）
传统DIA在建立实验谱库时往往要耗费大量的质谱时间，也不能涵盖样品中所有肽段的谱图信息。作者希望通过Prosit深度学习机制可以准确预测二级谱图及保留时间，直接用于DIA的建库，只需要提供理论肽段序列信息就可以构建任何物种的谱图数据库，可用于多个DIA以及Proteome Discoverer 2.5软件分析。
Prosit深度学习机制用于DIA分析。A, Prosit可准确预测保留时间；B，Prosit与多个DIA分析软件合作; C，Prosit也将可以在PD2.5软件检索流程中使用。（点击查看大图）
单细胞蛋白组学的“食谱”
01
单细胞分析的重要性
异质性：常规蛋白组学一般为基于细胞群体的研究，这样的常规分析不可避免会将大量细胞内的信息平均化。而在肿瘤研究以及生殖发育等重要的生物学过程中都涉及异质性。
样品量受限的样品：例如具有高活力和转移潜能的CTC细胞（循环肿瘤细胞），外泌体，细针穿刺和活检组织切片样品等。
02
单细胞分析流程优化
单细胞蛋白组分析中大的难点是样品量极少。而常规蛋白组样品前处理方法仅适用于大量细胞样品的处理；使用常规反应体系时酶解效率低；样品浓度很低（单细胞样品）时，同样降低酶解效率。因此，单细胞蛋白组学分析中，无法直接使用常规蛋白组学的方法，而是需要对每个过程进行优化。该讲座中给出了一个单细胞蛋白组学的专属“食谱”。
其中样品前处理，色谱分离和质谱分析部分的细节内容可参见“美梦成真——单细胞蛋白组分析的进化之路”，在此详细讨论讲座中的单细胞获取和如何提高样品前处理方法易用性。
03
如何获取单细胞
Ø 显微操纵获取单细胞
FACS获取单细胞需要一定的细胞起始量，在总细胞数不多的情况下，可通过显微操纵获取单细胞[1]。在显微镜的辅助下，使用毛细管直接从细胞悬浮液中吸取单个细胞至nanoPOTS中进行后续操作。
Ø 荧光激活细胞分选术FACS
nanoPOTS芯片，与FACS（荧光激活细胞分选）以及LC-MS联用用于单细胞蛋白组分析[2]。
Ø 激光捕获显微切割LCM
结合nanoPOTS样品前处理平台与LCM（激光捕获显微切割）的蛋白组成像[3]。
04
提高样品前处理方法易用性
除了开发样品前处理方法之外，研究人员也希望通过提高前处理方法的易用性，可以将该方法推广至更多的实验室。
Ø 适当提高反应体系，
应用商品化的微量移液器
在nanoPOTS的样品前处理过程中，需要使用自制的移液机器人吸取几十 nL级别的液体，并对操作人员的实验技巧有一定的要求。因此，研究人员比较了使用稍大的反应体积，例如几百nL级别（μPOTS）时的分析结果[4]，此时可使用商品化的一些微量移液器即可完成移液。在少于100个细胞的样品中也能获得不错的蛋白和肽段鉴定结果。
Ø 改造较低成本的移液机器人
可将商品化的低成本移液机器人改造成可配置微量注射器，可用于nL级别的移液，并进行后续的样品前处理。
将单细胞蛋白分析转变成常规分析还需要很长的路要走，TMT多重标记、微流控液滴技术、高灵敏度的纳升色谱柱、Orbitrap Exploris 480 及具有实时检索功能的Orbitrap Eclipse仪器以及FAIMS Pro接口势必会加速单细胞蛋白组的进化路程。
后一期中，我们会继续和大家分享线上预热讲座中生物制药的精彩内容，敬请期待。
参考文献
[1] Anal. Chem. 2020, 92, 2665−2671
[2] Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57: 12370-12374
[3] Nature Communicaitons, 2020, 11:8
[4] Analytical and Bioanalytical Chemistry volume, 2019, 411: 4587–4596
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