嗜热脂肪芽孢杆菌的鉴定方法及应用！

             嗜热脂肪芽孢杆菌的鉴定方法及应用！

嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，细菌繁殖体G兰氏染色阳性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。嗜热脂肪芽孢杆菌比较容易识别且对人体没有危害性，一般作为空间消毒的指示生物。由中国*2015年发布的《湿热灭菌用生物指示剂》（GB 18281.3-2015）于2017年01月01日正式实施，正式将嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）改称为嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）。

一、主要特性

嗜热脂肪地芽孢杆菌营养细胞呈长杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞宽 0． 6 ～ 1.μm、长 2. 0 ～ 3.5μm，细胞壁为革兰阳性结构，但染色可在阳性和阴性之间变化。芽孢呈椭圆或柱状、端生或次端生，孢囊膨胀或不膨胀，无伴孢晶体形成。生长温度为 56 ～ 60℃，生长温度为 65 ～ 75℃，低生长温度为 30 ～ 45℃，需氧或兼性厌氧，利用葡萄糖产酸不产气。现中国工业微生物菌种保藏管理中心( CICC) 收藏菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌编号为 CICC 10267 株，即 ATCC 7953 株，其在营养琼脂上56℃培养 24h 的菌落形态呈浅黄色，表面粗糙湿润，边缘不整齐 ; 该菌株在 Cook等产孢培养基上 56℃培养 24 h，取菌苔涂片经芽孢染色法染色后，1 000倍光学显微镜下观察到多数仍为染成红色的繁殖体与部分已经形成染成蓝色的芽孢形态 ; 在产孢培养基上 56℃培养 5 d，镜下观察到 90% 以上为已经形成染成蓝色的芽孢，只有少数是染成红色的繁殖体。

二、分类学演变历程

1917 年 Smith 等人在实验室分离出嗜热脂肪地芽孢杆菌，1920 年 Donk 将其归类于芽孢杆菌属( Bacillus) ，并命名为嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus)。传统分类上对于芽孢杆菌属的分类标准较为宽松，导致该属细菌在生理、基因等方面存在很大差异。近年来随着分类学研究的不断深入，DNA G + C mol% 、16S rDNA 序列分析、核酸杂交等分类技术的不断发展，芽孢杆菌属细菌的分类也得到更改与修正。 1949 年，Gordon 和 Smith对收集到的 216 株细菌进行分类研究，其中 160 株被归类于两个嗜热菌种：嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌( B． coagulans) ，他们认为这两个菌种各自代表了一组需氧、嗜热、形成芽孢的细菌。

1991 年 Ash等对 51 种芽孢杆菌属菌种的 16S rDNA 完整序列进行了分析，根据分析结果将它们分成 5 个不同的系统发育类群，并认为这 5 个类群明显代表着不同的菌属；同时提出芽孢杆菌属菌种在遗传方面相当混乱，需对其进行大量的分类学修正。Ash 等的研究成果标志着对芽孢杆菌属进行重新分类的开始，此后从 1992 年至 1999 年陆续从芽孢杆菌属中独立出 8 个新属。

2001 年，Nazina等对芽孢杆菌属的嗜热菌组群进行了生理特性对比研究，在此基础上，又对其进行脂肪酸分析、 DNA － DNA 杂交、16S rDNA 序列分析等一系列分类学研究。研究认为它们是一组系统发育相近、生理和形态相似的细菌，可以组成新的菌属，并就此提出了一个新的菌属名称: 地芽孢杆菌属( Geobacillus) 。Nazina 等将包括嗜热脂肪芽孢杆菌在内的 6 种菌从芽孢杆菌属分离出来，与近发现的新种一起归类为地芽孢杆菌属，该属已得到上的*。地芽孢杆菌属中现已确切描述并命名的共有 21 个种及亚种，模式种为嗜热脂肪地芽孢杆菌，模式菌株为 DSM 22T( = ATCC 12980 T) 。

菌种保藏机构如 ATCC 和 DSMZ，以及标准和药典等，已经将 Bacillus stearothermophilus 更名为Geobacillus stearothermophilus，国内仍称为嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus) 。

三、鉴定方法

对于嗜热脂肪地芽孢杆菌的鉴定，传统分类中根据形态特征、生理生化特性、生态特性等指标进行鉴定的方法耗时耗力，因此基于分子生物学的鉴定方法不断发展。2005 年， Daniel R． Zeigler报道了利用 recN 基因序列相似性分析鉴定地芽孢杆菌属菌种的研究。研究表明，对于属、种及亚种水平的分类，recN 基因序列分析的鉴定分辨率接近甚至比 16S rDNA 序列分析更高，但突变饱和度限制了 recN 基因序列对更高层次分类的应用，然而 recN 基因序列分析对地芽孢杆菌属菌株种的鉴定具有重要作用。2007 年，Nomeda Kuisiene等报道了利用 AluI 限制性内切 16S rDNA 扩增片段来鉴定嗜热脂肪地芽孢杆菌的方法。使用限制酶 AluI 将 16S rDNA 酶切，嗜热脂肪地芽孢杆菌的 16S rDNA 酶切电泳图将呈现出特殊条带: 162bp 条带的出现和 76bp 与 86bp 条带的缺失。同年，Nomeda Kuisiene等又报道，以 16S － 23S rDNA 内转录间隔区序列为靶基因设计特异性引物GEOBAC，以其 PCR 产物来鉴定地芽孢杆菌属菌种。这些快速而准确的鉴定方法为嗜热脂肪地芽孢杆菌及地芽孢杆菌属其它菌种的研究与应用奠定了基础。

四、应用

1、生物指示剂标准菌

嗜热脂肪地芽孢杆菌( ATCC 7953) 所产芽孢无致病性、无热原、无毒，且对压力蒸汽的抵抗力在大多数微生物中，因此被欧洲药典、美国药典、日本药典等作为热力灭菌生物指示剂的标准菌株收录。我国卫生部也将该菌株作为压力蒸汽灭菌效果评价的标准检测菌株列入《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》( GB 15981 － 1995) 和《消毒技术规范》( 2002 版) ; 同时，*也将其作为湿热灭菌用生物指示物列入《医疗保健产品灭菌生物指示物》( GB 18281.3 － 2000) 标准中。嗜热脂肪地芽孢杆菌( ATCC 7953) 用于制备生物指示剂重要的技术指标就是对一定灭菌因子有确定的抗力。 2002 年版《消毒技术规范》中明确规定嗜热脂肪地芽孢杆菌( ATCC 7953) 芽孢灭菌生物指示剂在 121℃ ± 0. 5℃ 条件下的抗力指标: 存活时间≥3.9min，杀灭时间≤19min，D 值为1. 3min － 1. 9min。然而同一菌株培养出的芽孢，其抗力也可能不同，此与培养方法和营养成分有关。Beaman等对该菌株粗糙型和光滑型芽孢 100℃条件下的 D 值进行了测定，分别为 124 min 和579 min，因此制备生物指示剂必须严格确定菌株与菌落形态。此外，培养基成分不但对芽孢生成率有显著影响，对芽孢的热抗力也有明显作用，如芽孢形成培养基中钙离子浓度增加，可使芽孢的热抗力增加。芽孢的形成温度对芽孢的热抗力也有一定影响，Cook 等的研究表明，在 50℃、55℃、60℃ 条件下形成的芽孢，培养温度越高抗热能力越强。综上所述，生物指示剂的热抗力受多种因素影响，故对其制备条件应予严格控制; 同时对生物指示剂产品，必须使用符合标准的抗力检测器对其抗力性能进行严格测试。

2、鲜乳中抗生素残留检验

长期以来，抗生素在奶牛饲养业中应用广泛，如为预防或治疗疾病，常在饲料中添加含有一定比例抗生素的饲料添加剂，这对于长期饮用牛奶的消费者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，因此必须严格控制抗生素残留*。国标 CB/T 4789. 27 － 2008 中规定了两种检测鲜乳中抗生素残留的方法 － 嗜热链球菌抑制法和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法。嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法中所用菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌卡利德变种( Bacillus stearothermophilus var． calidol- actis)，该菌种在的保藏机构 DSMZ 中已更名为嗜热脂肪地芽孢杆菌。该菌种对青霉素等抗生素非常敏感，生长速度快，此外其还有一个重要特性是生长温度范围较高，仅有少数微生物可在该温度范围内生长，因此杂菌影响结果的可能性很小。

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