支原体是细胞外生存的小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细菌，也不同于病毒。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支原体等。支原体只能黏附在呼吸道或泌尿生殖道的上皮细胞表面的受体上，而不进入组织和血液。目前诊断支原体感染用的是培养法、血清学检测法和基因诊断。
分离培养法
分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测准确度高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上*生长，终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候。
DNA检测
DNA 检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料(如Hoechst染料)染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体菌株并不可靠，而DNA法可以准确的将其检测出来。
PCR法
PCR 法也可以检测菌株，PCR法检测支原体只需几个小时，是不灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见可同时使用另一种检测方法来进行验证。
酶学检测和ELISA
此外，也还存在一些其他支原体检测方法。例如酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。
定期检测
支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
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