噬菌体的分离、纯化及效价测定

一、目的要求
1、学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。
2、学习噬菌体效价测定的基本方法。

二、基本原理
因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现奇特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易的分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以，（a）在液体培养基内可使混浊菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体；（b）在宿主细菌生长的固体琼脂  平板上，噬菌体可裂解细菌而形成透明的空斑，称噬菌体斑（图1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。
本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌  噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再进一步纯化。
噬菌体的效价就是1 毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌  的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌体斑，因此，能进行噬菌体的计数。


二、器材
37℃培养18 小时的大肠杆菌斜面，阴沟污水；
本实验均用普通肉膏蛋白胨培养基500 毫升三角瓶内装三倍浓缩的液体培养基100 毫升，试管液体培养基，琼脂平板，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，没管4 毫升），底层琼脂平板（含培养基10 毫升，琼脂2%）大肠杆菌 18 小时培养液，大肠杆菌噬菌体 10-2 稀释液（用肉膏蛋白胨液体培养基稀释）含 0.9 毫升液体培养基的小试管 4 支，肉膏蛋白胨琼脂平板（ 10 毫升培养基， 2 ％琼脂，作底层平板用），含 4 毫升琼脂培养基的试管（ 0.7％琼脂，作上层培养基用）5 管，灭菌小试管 5 支，灭菌 1 毫升吸管10 支，48 ℃ 水浴箱等。灭菌吸管，灭菌玻璃途布器，灭菌蔡氏细菌滤器，灭菌抽滤器，恒温水浴箱，真空泵等。