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探讨荧光定量PCR中的Ct值

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2021/9/15 15:19:40

荧光定量PCR(qPCR)是目前病原检测领域使用最为广泛的核酸检测方法(PCR检测技术概述)。尤其是非洲猪瘟发生后,qPCR检测得到了极大的普及,对于刚刚进入qPCR检测领域的人,很容易钻入了“唯Ct值”的牛角尖,今天我们就聊聊qPCR中的Ct值。

一、Ct值的基本概念

1、什么是Ct值

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值,荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线(baseline),是由于测量的偶然误差引起的。阈值(threshold)一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号,用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响,每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同,进而影响阈值和Ct值。

模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,Ct值的重现性较好,即相同含量的初始模板,得到的Ct值是相对稳定的。

Ct值不是恒定不变的,可以受到不同样品、不同仪器的影响,即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍,Ct值也会存在差异。


2、与Ct值有关的参数

标准曲线Standard curve:模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。

相关系数Correlation coefficient (R^2) :反映了标准曲线的线性,通常要求>0.99。

扩增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%,是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

斜率Slope :当扩增效率为100%时斜率为-3.32,当90%-110%时的斜率为-3.58 ~ -3.10。


3、Ct值与模板拷贝数的关系

理想情况下,qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增,扩增循环数和产物量之间的关系是:扩增产物量Cn=起始模板量C1×(1+扩增效率E)^循环数n。但是由于E通常无法达到100%,并且在扩增的后期,扩增效率会逐渐降低,只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n,即Ct值差1,初始浓度差2倍。

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前的qPCR定量的方法,即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增,将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时,一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足:E:90%~110%,R^2≥0.99,斜率-3.58 ~ -3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。

用qPCR进行定量,理论上可行,实际上很难获得准确的定量结果。


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