细菌的纯种分离培养和接种技术

培养基的制备原理
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
操作步骤
1、计算称量 根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。
2、溶解 一船情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待*溶解后，补足水分到需要的总体积。
3、调节pH 用滴管逐滴加入1N NaOH或lN HCl边搅动；边用pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止。
4、过滤 要趁热用四层纱布或滤纸过滤。
5、分装 按照实验要求进行分装。
6、加塞 培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上棉塞。
7、灭菌 在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。

细菌的的分离与接种技术
生长上应用的菌种必须是纯种，但是筛选菌种时通过增殖培养后得到的菌种并不是纯种，还需进行纯种分离；就是在生产上长期应用的菌种，由于长期使用，也容易发生退化与变异，也需进行纯种分离。因此纯种分离是微生物学的主要技术之一，操作务必熟练。常用接种方法有：固体培养基接种、半固体培养基接种、液体培养基接种。

材料
1.菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌
2.接种工具： 接种环、酒精灯、接种箱

方法
1.固体培养基：
（1）连续划线适合于接种材料中含菌不太多的标本（如尿液等）或培养物。
（2）分区划线适合于粪便等含菌量较多的标本或污染菌种的分离纯化。
在培养皿底部注明接种菌名、接种者姓名、日期等，将平皿倒置于37℃温箱中。（为什么？）
（准备室应给准备好分区划线和连续划线的示教）

2.半固体培养基：穿刺接种
不可穿至管底（3/4），循原路退出。37℃温箱中培养。
今年为新换菌种（变形杆菌），动力很好。

3.液体培养基：
取标本后在接近液面的管壁上轻轻研磨，并粘取少许肉汤调和，使细菌混合于肉汤中。37℃温箱中培养。

观察细菌的生长现象
不同种类的细菌在培养基上生长，往往表现为不同的生长现象，可以通过生长现象的观察，进行细菌的初步鉴定。

材料
菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乙型链球菌、变形杆菌
培养基：固体培养基、液体培养基、半固体培养基

操作
1．固体培养基多用于观察细菌的菌落、菌苔、细菌的分离培养或纯培养。

可将菌落分为三个类型：
（1）光滑型菌落（Smooth type Colony）：又称S型菌落，此种菌落特点为表面光滑、湿润、边缘整齐、至于其它特点如凸起或扁平、色素、透明度、溶血等可因菌种而异。
（2）粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型菌落，此种菌落表面粗糙、干燥、边缘不整齐。
（3）粘液型菌落（Mucoid type Colony）：又称M型菌落，此型菌落表面光滑、湿润、呈粘液状，以接种环触之可拉出丝状物，“成丝试验”阳性可作为鉴别，如肺炎杆菌。
固体平板上，菌量多的部分，菌落常融合成片，形成菌苔，菌苔一般不做为鉴定的指标。

2．半固体培养基多用于观察细菌的动力。（金黄色葡萄球菌、变形杆菌）
在半固体培养基中，无鞭毛细菌沿接种线生长，接种线清晰，培养基澄清；有鞭毛细菌弥散生长，接种线模糊不清，周围培养基变混浊；借此可以判断细菌有无动力。

3．液体培养基接种多用于测定细菌的生化反应（肉汤、葡萄糖蛋白胨水、各种单糖发酵管等液体培养基）、工业微生物发酵、观察细菌的不同生长现象。
肉汤在未接种细菌前是澄清的，接种细菌后可有以下三种生长现象：
（1）混浊生长：液体变混浊。 （大肠杆菌）
（2）沉淀生长：上层培养液澄清，管底有絮状或颗粒状沉淀物。（链球菌）
（3）形成菌膜：培养液澄清，表面形成一层菌膜。 （枯草杆菌）哪些细菌在液体培养基中可形成菌膜？

细菌的分布
细菌种类多、繁殖快、适应环境能力强，因此，细菌广泛分布于自然界，在水、土壤、空气、食物、人和动物的体表以及与外界相通的腔道中，常有各种细菌和其它微生物存在。在自然界物质循环上起重要作用，多数对人类有益，对人致病的只是少数。

材料
1、普通固体培养基 血琼脂平板
2、碘酒、肥皂、自来水等

方法
1、空气中的细菌大多为非致病菌，是实验操作污染的重要来源。检查时用普通琼脂平板，打开平板盖，放置10min。37℃温箱中培养。
2、手指上有细菌存在，检查消毒前后细菌分布情况说明为什么要饭前便后要洗手，病从口入的道理。选择男女各一名同学。
3、飞沫中有细菌，说明为什么不要对着人咳嗽、打喷嚏，不仅不礼貌，从微生物学角度来说，可以传播一些疾病。（检查飞沫中的细菌为什么要用血琼脂平板）。
微生物不仅在自然界分布广泛，在人体的体表以及与外界相通的腔道，存在着不同种类和数量的微生物。成年人体有1013个细胞，而细菌却可达1014，其重量达1271g，近3斤，其中肠道中有1000g，粪便干重的1/3是细菌，皮肤上有200g，口腔、鼻腔、外耳道、泌尿生殖道、眼部有71g。
微生物种类繁多、分布广泛，建立起“微生物无处不有的概念”， 严格无菌操作，树立牢固的无菌观念。

注意事项
是否R型菌落的细菌致病性都弱？比较日照与济宁空气质量。下次实验看细菌分布实验的结果。注意无菌操作，培养树立牢固的无菌概念是微生物学实验的一项重要任务。