本期分享第三期的细胞培养常见问题的内容，希望对大家有所帮助啦~
20. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
(1) 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
(2) 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
(3) 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
(4) 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
(5) 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
(6) 重复步骤4。
(7) 在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。
21. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
22. 支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数，代谢及研究的任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。
23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株，但是如果您的样本珍贵，建议您使用支原体去除试剂去除污染
24. CO2 培养箱的水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25. 为何培养基保存于4℃ 冰箱中， 颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4℃冰箱中，培养基内的CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整pH 值。
26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同的dish 或flask 而有显著的生长差异。
27. 购买的细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少的情形？
研究人员在冷冻细胞的培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
28. 购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80℃太久。
29. 如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:
(1) 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。
(2) 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。
(3) 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
(4) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。
(5) 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
30. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
31. GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121℃灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎*降解。
32. 什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，不用加。
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