调控焦虑行为和空间记忆

D28K是一种Ca2+结合蛋白，被认为对Ca2+依赖的神经元变性具有保护作用。基底前脑胆碱能神经元中D28K蛋白的表达随着AD患者年龄的增长而减少，这表明D28K+胆碱能神经元在AD早期比较缺乏，可能导致焦虑样行为表型的发展。

内侧隔核（MS）中的胆碱能神经元是前脑胆碱能输入的主要来源，调节包括感觉处理、记忆和注意力在内的多种功能。迄今为止，大多数研究都将胆碱能神经元作为一个单一的群体来处理，因此，支撑其功能多样性的神经机制仍然未知。

首先，课题组以荧光原位杂交技术发现所有胆碱能神经元都表达GABA能神经元标志物——VGAT，且MS脑区中D28K+ 和D28K-信号分别主要表达在脑区边缘和中央。随后，课题组选用MS脑区作为研究对象，对表达D28K+ 和D28K-信号的神经元进行形态学观测和电生理记录，发现与D28K+神经元相比，D28K-神经元具有多极性，放电频率更高，且簇状放电现象更明显，这表明两种神经元具有差异性。

随后，课题组通过顺行病毒示踪发现D28K+神经元主要投射至CA1海马腹侧锥体神经元（VPNs），而D28K-胆碱能神经元主要投射至背侧齿状回颗粒神经元（DGNs）。这一发现表明，上述胆碱能系统包含至少两个具有不同特性的神经网络。进一步电生理实验表明D28K+到VPNs的突触传递同时由Ach和GABA介导，而D28K-/到DGNs的投射仅由Ach介导。

随后，课题组以单细胞测序技术发现D28K+神经元大量富集表达编码Eag1钾离子通道的kcnh1基因，而D28K-神经元富集表达编码低电压门控钙离子通道的cacna1h基因。电生理结果显示：敲除MS区域D28K+神经元kcnh1基因后其动作电位放电频率增加，阈值降低；而敲除D28K-神经元cacna1h基因后其动作电位放电频率降低，簇状放电的锋电位减少。

为了探究kcnh1基因对小鼠行为学的调控作用，课题组敲除D28K+胆碱能神经元的kcnh1基因后发现：小鼠在水迷宫测试中的空间记忆能力没有影响，但其在高架十字迷宫（EPM）开放臂中的停留时间和进入次数、旷场（OF）中央的停留时间以及新物体识别测试（NO）中对陌生物体的探索时间显著降低，即表现出焦虑样症状。而化学遗传抑制D28K+/VPNs环路后明显改善了上述焦虑行为；此外，腹侧海马CA1区域注射胆碱能受体拮抗剂（MEC和 ATR）有效逆转了上述焦虑行为的发生。

随后，课题组通过特异性敲除小鼠D28K-神经元的cacna1h基因并发现突变小鼠在EPM、OF和NO试验中均表现正常，但在基于触摸屏的空间记忆测试中，表现出空间记忆障碍——突变小鼠在距离较近的两个光照房间（low separation task -LST)里找出目标房间的尝试次数增加；此外，突变小鼠在水迷宫中的逃离时间也增加。而θ脉冲（TBS）刺激腹侧背侧海马DG区能够明显改善上述空间记忆障碍。

总的来说，本文主要通过形态学观测和电生理实验鉴定了两种不同类型的胆碱能神经元——D28K+和D28K-神经元。并发现D28K+胆碱能神经元主要调节焦虑样行为，而D28K-胆碱能神经元主要调节空间记忆。该研究表明——恢复D28K+胆碱能神经元中D28K的表达可能是AD治疗的有效细胞靶点。