动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，优先发生在暴露于扰动血流（d-flow）的动脉分支或弯曲区域，而稳定血流（s-flow）的区域则受到保护，免受动脉粥样硬化的影响。内皮细胞 （ECs） 在管腔和其表面、细胞-细胞连接处和细胞骨架上配备了几个机械传感器，可检测流体剪切应力并触发信号通路和细胞反应的级联。d-流在很大程度上通过调节对流动敏感的编码基因和非编码基因以及表观遗传修饰因子来诱导内皮功能障碍和动脉粥样硬化。使用动脉粥样硬化和转录组学研究的部分颈动脉结扎（PCL）小鼠模型，在ECs中鉴定了数百个血流敏感基因，与右颈动脉（RCA）中的s-流相比，这些基因通过左颈动脉（LCA）中的d-流而变化。在对流动敏感的基因中，激肽释放酶10（Klk10）被确定为对血流最敏感的基因之一，在s-流下具有高表达，在d-流下低表达。然而，其在内皮功能和动脉粥样硬化中的作用尚不清楚。
KLK10最初被鉴定为正常的上皮细胞特异性1（NES1）基因，并且是激肽释放酶相关肽酶“KLK”家族的成员，该家族由15种分泌丝氨酸蛋白酶组成。KLKs参与各种各样的过程，从皮肤脱屑到牙齿发育，高血压和癌症。KLK10最初被发现是一种潜在的肿瘤抑制因子，其在乳腺癌，前列腺癌，睾丸癌和肺癌中的表达下调。然而，进一步的研究表明，由于KLK10在卵巢癌，胰腺癌和子宫癌中过度表达，因此情况更为复杂。然而，KLK10对内皮功能和动脉粥样硬化的作用尚不清楚。
在美国埃默里大学与佐治亚理工学院库尔特生物医学工程系、中国北京大学生物工程系、英国伦敦帝国理工学院化学系等团队的一项联合研究中，验证了KLK10介导s-流的抗动脉粥样硬化作用，而d-流条件下KLK10的损失导致促动脉粥样硬化生成作用的假设。
KLK10在体外和体内ECs中通过s-流增加，d-流降低
为了验证KLK10在体内表达的血流依赖性调节，进行了小鼠PCL手术以诱导LCA中的d-流，同时维持RCA中的s-流（图1 a）。与 LCA 的 d-flow相比， ECs 中KLK10的蛋白（图1 b、c）和mRNA表达（图1 d）在RCA 的 s-flow 中显著更高。有趣的是，KLK10蛋白也存在于外膜中，偶尔在内皮下层中也观察到（图1 b）。此外，KLK10蛋白在较小曲率区域（LC，自然和长期暴露于d-流的动脉粥样硬化易发主动脉弓区域）与较大曲率区域（GC，自然和长期暴露于s-流的动脉粥样硬化保护的主动脉弓区域）相比，表达降低（图1 e、f）。
接下来，将人主动脉ECs（HAECs）暴露于单向层流剪切（LS，15 dynes/cm2）或振荡剪切（OS，±5 dynes/cm2，1 Hz）下24 小时，分别模拟体内的 s-流和 d-流条件，测试血流是否可以调节KLK10的表达。KLK10 mRNA （图1 g）、细胞裂解物中的KLK10蛋白（图1 h、j），以及条件培养基中的分泌蛋白（图1 j）被OS降低，LS增加，证实了KLK10在体内和体外作为流动敏感基因和蛋白质的作用。
通过重新分析单细胞 RNA 测序（scRNAseq）和 scATACseq 数据集，进一步证实了 Klk10 的流动依赖性表达。如 scRNAseq 数据分析（图1 k），Klk10转录本表达在s-流中最高，对d-流的反应降低。scATACseq 数据（图1 i）表明，Klk10启动子区域仅在暴露于s-流条件下的EC中是开放和可访问的（表明转录状态活跃），但在d-流条件和所有其他非EC类型的EC中是封闭和不可访问的（表明转录状态不活跃）。这些结果表明，Klk10表达在表观基因组和转录组水平上受到EC中血流的有效调节，支持上述体外和体内结果（图1 b-g）。
图1 在体外和体内，内皮细胞（ECs）中KLK10表达被扰动流（d-flow）抑制，稳定流（s-flow）升高。
KLK10抑制内皮炎症并保护通透性屏障
接下来，通过评估KLK10在内皮炎症反应，管形成，迁移，增殖和凋亡中的作用来测试KLK10是否调节EC功能，这些作用在动脉粥样硬化的发病机制中起关键作用。rKLK10对人脐静脉ECs（HUVECs）的迁移和管形成可显著抑制，但不能抑制增殖和凋亡（图2）。此外，rKLK10以浓度依赖性方式显著抑制单核细胞对ECs的粘附（图2 b）。值得注意的是，如果加热rKLK10，rKLK10的抗炎作用就会丧失，这意味着KLK10的酶活性或天然构象的重要性（图2 b）。此外，rKLK10处理显著抑制促炎粘附分子VCAM1和ICAM1的mRNA和蛋白质表达（图2 c-g）。
然后，测试了KLK10在体外和体内流动条件下对内皮炎症反应的影响。rKLK10 处理抑制 OS 诱导的 HAECs 中的单核细胞粘附（图2 h）。相反，siRNA介导的KLK10敲低在LS条件下显著增加了单核细胞的粘附（图2 i）。接下来测试了rKLK10是否也可以抑制小鼠主动脉弓流动紊乱的LC中的内皮炎症。结果表明，rKLK10显著降低了这些小鼠主动脉弓d-流（LC）区域中VCAM1的表达（图2 j、k）。这些结果表明，在TNFα或d-flow条件下，使用质粒或rKLK10处理的KLK10过表达在体外和体内均可防止EC炎症，而通过d-flow或KLK10 mRNA敲低来降低KLK10的表达会增加炎症。
图2 KLK10在体外和体内抑制内皮细胞炎症。
由于NFκB是一种促炎转录因子，其诱导VCAM1和ICAM1的表达以及随后单核细胞对ECs的粘附，因此测试了KLK10是否抑制NF-κB活化以响应剪切应力和TNFα。实验首先发现KLK10阻止了磷酸化（p-Ser536）和p65的跨核定位，这是NFκB活化的两个重要标志物。KLK10还利用LS条件阻止p65的跨核定位以响应急性剪切力刺激。
接下来测试了rKLK10处理是否可以保护ECs的渗透性屏障功能。作为阳性对照，凝血酶处理增加了HAECs的渗透性。rKLK10预处理阻止了凝血酶在HAECs中诱导的通透性增加（图3 a、b）。同样，rKLK10降低了OS引起的渗透率（图3 c、d）。这些结果证明了，KLK10在内皮炎症和屏障功能中的保护作用。
图3 KLK10保护内皮通透性免受凝血酶和振荡剪切（OS）的影响。
rKLK10处理可抑制Apoe−/− 小鼠的动脉粥样硬化
鉴于rKLK10在ECs中的抗炎和屏障保护作用，实验测试了是否可以通过用rKLK10处理小鼠来预防动脉粥样硬化的发展。通过尾静脉注射rKLK10显著减少LCA中的动脉粥样硬化发展和巨噬细胞积累。rKLK10处理显示对血浆总胆固醇、LDL（低密度脂蛋白）和HDL（高密度脂蛋白）胆固醇和甘油三酯没有影响。因此，rKLK10在体内显示出抗动脉粥样硬化作用。
超声介导的KLK10过表达抑制Apoe−/− 小鼠的动脉粥样硬化
接下来，使用质粒载体过表达KLK10是否也可以抑制体内动脉粥样硬化。与对照组相比，KLK10过表达小鼠LCA中动脉粥样硬化斑块的形成显著减少。通过苏木精和伊红组织化学染色进一步评估颈动脉切片，显示这些小鼠LCA中的斑块面积减少。处死时用ELISA测量的小鼠循环血浆KLK10水平显示荧光素酶组和KLK10组之间没有可测量的差异。这可能是由于处死时质粒表达减弱。然而，发现LCA和RCA的内皮层的KLK10染色水平较高，蛋白质印迹显示肺组织样本中也有KLK10染色。实验观察到，血浆总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和非高密度脂蛋白在KLK10注射的小鼠中与对照小鼠相比没有显著差异。这些结果表明，通过rKLK10或KLK10表达载体处理KLK10都可以抑制Apoe−/− 小鼠动脉粥样硬化的发展。
KLK10在伴有晚期动脉粥样硬化斑块的人冠状动脉中表达降低
最后，实验检查了KLK10在具有不同程度动脉粥样硬化斑块的人冠状动脉组织切片中的表达是否改变。KLK10和CD31免疫染色表明，KLK10 表达在斑块明显的动脉内皮层（4-6级，图4 a、b），比病变较轻的动脉（1-3级）明显降低。
图4 KLK10在具有晚期动脉粥样硬化斑块的人冠状动脉中表达降低。
图5 对血流敏感的KLK10可抑制内皮炎症并保护通透性屏障，最终减少动脉粥样硬化。
KL10在基因组和蛋白质水平上被s-流上调，被d-流下调。在KLK10表达较高的s-流条件下，KLK10抑制NFκB以及血管细胞粘附分子1（VCAM1）和细胞内粘附分子1（ICAM1）的表达，从而阻止单核细胞粘附。此外，由 s-flow 产生的 KLK10 可保护内皮通透性屏障。总之，KLK10的抗炎和屏障保护作用导致对动脉粥样硬化的整体保护。
总之，该研究证明了KLK10是一种对流动敏感的蛋白质，在ECs中被s-flow上调，被d-flow下调。结果还表明，KLK10是ECs 中s-flow以自分泌方式抗炎、屏障保护和抗动脉粥样硬化作用的有效中介（图5）。KLK10可作为潜在的抗动脉粥样硬化治疗靶点。
参考文献：Williams D, Mahmoud M, Liu R, Andueza A, Kumar S, Kang DW, Zhang J, Tamargo I, Villa-Roel N, Baek KI, Lee H, An Y, Zhang L, Tate EW, Bagchi P, Pohl J, Mosnier LO, Diamandis EP, Mihara K, Hollenberg MD, Dai Z, Jo H. Stable flow-induced expression of KLK10 inhibits endothelial inflammation and atherosclerosis. Elife. 2022 Jan 11;11:e72579. doi: 10.7554/eLife.72579. PMID: 35014606; PMCID: PMC8806187.
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