根据酶分子大小和形状的分离方法
(1)离心分离 许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，因此匀浆处理后应先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，如细胞核、线粒体、溶酶体等，使酶先富集10-20倍，然后再对某一特定的酶进行纯化。一般离心力越大，离心时间就越短。
(2)凝胶过滤 分离酶蛋白时，分于大小大于凝胶孔径的蛋白被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的分子蛋白就被分开了。此外，凝胶过滤法还可用于测定未知蛋白的分子量。
(3)差速离心和等密度梯度离心分离 对于某一悬浮液，可先选用较低的转速进行离心，但分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。如果制备的离心介质的密度梯度范围包括了待分离样品中所有颗粒的密度，那么经较长时间的离心后，各种颗粒沉降在与其密度相同的位置，这种离心称为等密度梯度离心。常用的离心介质有氯化铝、澳化钾、碘化钠等，这种方法在核酸研究中应用更为广泛。
(4)透析与超滤 透析在纯化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。例如细菌蛋白酶经丙烯睛滤膜一次超滤后可浓缩5倍左右，去除杂蛋白50%，去除于物质70%，而酶活性保持75%以上。
根据酶分子电荷性质的分离方法
(1)离于交换层析 根据不同的蛋白质与离于交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。 由于不同的蛋白质分于暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，因此在一定PH值和离于强度的缓冲液中，所带的电荷情况也不相同的。因此在 上样时应注意加人的蛋白量及样品体积尽可能小，才能得到较高的分辨率。洗脱时，可以通过改变洗脱剂的离子强度，减弱蛋白质与载体亲和力的方法，逐一洗脱各蛋白组分；也可通过改变洗脱剂的PH值，使蛋白质的有效电荷减少而被解吸.
(2)等电聚焦电泳 它属于移动界线电泳法。具体操作方法如下：先从阳极顶端扩散装人一种酸如磷酸，然后从阴ji端扩散装人一种碱如乙醇胺，这样便可在两端间建立起一PH梯度，此种PH梯度可以利用引人两性电解质混合物而加以稳定。一般是用合成的或是天然的氨基酸当作两性电解质混合物，而选用的等电点值要涵盖所需的PH值。电泳时间可能需要数天，用这种方法可以分离和检出等电点相差仅0.02的两种蛋白成分。
(3)层析聚焦 层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的PH梯度是在固相离于交换载体上形成的。它既具有等电聚焦的高分辨率，又具有柱内容量大的特点，具有较大的应用价值。3)电泳 在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。 为减少扩散，整个过程通常是在多孔性的固体载体如淀粉胶上进行的。由于电泳分离的样品量较小，常作为分析用；但现在已发展了制备电泳，用这种方法制备的酶，可以在介质中洗脱或直接从电泳柱底部依次流出。
