永生化红细胞(RBC)前体的单克隆筛选

人造血液尝试始于七十多年前，1900年，奥地利医学家卡尔·兰德斯坦纳发现了ABO血型，让输血救人成为了可能。目前，接受手术、癌症治疗和创伤治疗的患者所需的血液供应依赖于志愿献血者。由于需求量大，研发人造血液以替代人自身血液的想法便产生了。到了20世纪中后期，由于献血和输血造成一些传染病如艾滋病、乙肝、丙肝等的传播和流行，也让人对输血用血产生恐惧，因此人们正在努力开发一种更安全、更容易获得的血液供应来源。

这一挑战通过可能的血液嫁接来解决，利用胚胎细胞、骨髓细胞或诱导干细胞在体外产生血细胞。通过癌基因能够增加细胞增殖和减少细胞死亡的能力，来促进通常难以连续培养的红系祖细胞系的细胞生长，往往在培养中细胞系有强劲的增长，但细胞群表现出多异质表型。由于Cytena克隆筛选单细胞打印系统（single-cell printer™，scp™）能够高通量生成单细胞克隆，以识别具有理想红系标记表达的克隆。利用这一工作流程，获得200多个单克隆可用于进一步的表达标记分析。

本研究为了实现分化的去核血细胞的持续供应，开发了从转染到单细胞克隆的工作流程，以选择克隆进一步分化为成熟的红细胞(图1)。首先，将5种不同的癌基因(c-myc, BCL-XL, SV40, geT, Bmi-1, LhX-2)单独或成对地转染到来自CD34+干细胞的红系祖细胞系中。

图1 红系细胞克隆生成流程

注：转染48小时后，通过向培养物中添加dox激活癌基因表达，从而实现持续培养。使用single-cell printer™进行单细胞克隆的筛选，挑出具有表面标记的特异性单克隆，在通过添加干细胞因子(SCF)和促红细胞生成素(EPO)进一步分化，进一步分化为红系细胞。

转染48小时后，通过添加强力霉素(dox)激活癌基因表达。发现个体癌基因转导不会导致细胞永生化，只有联合转导c-myc和BCL-XL才能使红系前体细胞永生化，细胞可以在培养中保存并增殖一年以上(图2A)，除了长期培养的能力外，永生化细胞还表现出早期造血祖细胞的典型标志物，包括CD34^{very low}CD45^+/-CD133^+/-CD71⁺CD44^highCD105^highCD235a^{very low}。然而，去除dox致癌基因表达失活，使进一步分化成为可能(图2B)。

      注：图2（A）永生化红系祖细胞的增殖率。（B）去除dox降低了三种不同细胞克隆的c-myc和BCL-XL癌基因的mRNA表达(编号8,29和34)。

与传统方法相比，single-cell printer™提供了一种高通量分离单细胞克隆的方法，用于进一步的下游分析和筛选。此技术基于类似喷墨的原理，将细胞样品加入至包含微流体结构的芯片中，芯片的底部有一个喷嘴，自由飞行的小液滴在那里被分配，对喷嘴进行连续成像，以确定产生的液滴中是否含有0、1或多个细胞，如果一个液滴含有一个细胞，它将被分配到目标孔板，如果液滴不包含细胞/多个细胞，液滴将作为废物处理。

红系祖细胞被分配到5个充满半固体培养基的96孔板（兼容384孔板）。连续的五张图像(图3A)作为单克隆源性的保证，并确保只分配了一个细胞。经统计有97.7%的孔(469/480)分配到单个细胞，其中超过200个可以形成单克隆，在进一步分析形态和表面标记物中发现表达较理想(CD71、CD45、CD34、CD235a)。从培养物中去除Dox，在7天内进一步分化为产生血红蛋白的细胞(图3B)，突出了可能发育为成熟红细胞的潜力。

注：图3（A）single-cell printer™记录沉积到目标板中的单个细胞来源的克隆性保证，单细胞沉积效率为97.7%。（B）红系祖细胞克隆(29)进行进一步分化，去除dox，加入SCF和EPO。通过染色显示，培养物中存在产生血红蛋白的细胞。

本研究表明，通过转染c-myc和BCL-XL癌基因，典型的非分裂前体RBC前体可以获得永生化。所得到的细胞系是异质的，需要单细胞克隆来筛选理想的细胞特征。与传统方法相比，single-cell printer™在保持细胞活力的同时，实现了高通量、稳健的单细胞克隆开发方法，能够产生超过200个克隆，这些克隆后来被进一步分化并鉴定为具有关键的祖细胞标记物。

参考文献

single-cell printer™ | Generating single-cell clones of immortalized red blood cell (RBC) precursors using single-cell dispensing. Romy Kronstein Widemann¹, Stefan Zimmermann², Torsten Tonn¹.

关于Cytena公司

Cytena公司潜心研究单细胞打印机（single-cell printer™）技术多年，不断升级设备功能，以一贯温和的分选原理、更加快速的分选效率、更加简易的操作步骤，助力抗体、细胞治疗、基因治疗、干细胞等研究领域的客户快速搭建单细胞筛选平台。艾贝泰生物科技有限公司作为Cytena的单细胞打印机总代理商，为您提供优质的售前售后服务。