1. 如何对污染进行监测？
RNA质量控制分为三个部分，一是浓度，二是纯度，三是完整性。对于基因表达实验来说，了解物质的起始浓度是很重要的。在比较来自不同样本的结果时，应使用相同的样本量。此外，确定材料的起始浓度也可以对后续的实验步骤进行优化。样本可能会被蛋白质、基因组DNA或其他有机化合物污染。这种污染可能会影响RNA的量化，同时下游应用及其结果的相关性也可能受到这种污染的影响。基因组DNA、DNA结合蛋白、酚类化合物或在RNA提取过程中引入的外源性颗粒（如手套中的粉末），已被证明可以抑制下游逆转录和PCR扩增步骤。与DNA相比，RNA是一种相对不稳定的分子。因此，RNA的完整性是RNA样本整体质量的重要组成部分。为了避免降解，RNA样本必须小心地保存，或者在非常低的温度下沉淀或者冻干。
为了比较基因表达数据，必须使用可靠的标准化方法。MIQE指南强调，所提供的实验数据应包括仪器信息、RNA提取方法以及RNA样本的浓度、纯度和完整性。高质量的RNA应当避免RNA酶的污染，勤换手套，使用无RNA酶的试剂和耗材，使用专门的无RNA酶设备用于提取，设立PCR前和PCR后的实验分区。取样时尽可能缩短取样时间，于液氮中快速冷冻，加入适量的裂解缓冲液和RNA保护剂。在RNA提取时，确保组织在裂解过程中是冷冻状态，并使用RNA酶抑制剂。提取的RNA在适宜条件下存储，-80℃可长期保存，避免反复冻融。如何明确用于RT-qPCR检测的RNA是否合格？接下来给大家详细介绍一下RNA质控的具体方法。
2. 总RNA质量控制方法
RNA质量控制可以多种方法进行，它们适用性也各不相同。
分光光度计
总RNA可以利用紫外光的强吸附特性使用核酸分光光度计进行定量，但缺陷是这种紫外光谱方法并不能区分不同类型的核酸，因此常见的污染物如基因组DNA可能会显著影响测定结果。为了更精确的RNA定量，污染的基因组DNA必须被DNA酶消化去除。游离核酸也有助于增加在260nm处的吸收，因此可能需要在DNA酶处理后进一步纯化总RNA。通过测定样品的OD值去评估RNA纯度，OD260/280在1.9-2.1之间的样本纯度较好，当OD值小于1.9，说明有蛋白质残留，OD值大于2.1说明RNA可能发生降解。该方法适用于测定总RNA的浓度和纯度；然而，这种方法不能提供任何关于RNA完整性相关的信息。
荧光染料测定
另一种评估RNA浓度的高灵敏度方法是测量与RNA结合并在结合时发出选择性荧光染料的荧光强度，例如RiboGreen®。染色后的样品可以用荧光计在试管或微孔板上进行定量。基因组DNA残留会影响测定结果，因此为了更准确的RNA定量，用DNA酶处理是必要的。此外，基于荧光染料的总RNA定量只测量聚合的核酸，而不会检测到受污染的蛋白质和游离的核糖核苷酸。这种敏感的方法对RNA丰度非常低的样本非常有用。MIQE的RNA定量指南推荐采用基于荧光的检测方法。然而，它只适用于总RNA的定量，并不能提供关于RNA的纯度和完整性的相关信息。
3'：5'完整性分析
以GAPDH作为目标序列的 3'：5'检测已被提出作为mRNA完整性的替代测量方法。在GAPDH mRNA序列的三个单独的qPCR检测中，GAPDH mRNA序列的5'端、中间和3'端区域均有目标扩增子。所描述的三重检测使用TaqMan®化学方法进行，每个扩增子均由靶标特异性差异标记的探针检测。3'：5'比率描述了3'端和5'端的信号强度的比较。这个值反映了mRNA模板的完整性。3'：5'的比值约为1表示mRNA完整性高，而值大于5表示mRNA降解。所获得的数据独立于核糖体RNA的完整性，并提供了mRNA降解的可量化测量方法。这种分析方法特别适用于在RNA很少时珍贵样本的分析。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳被广泛应用于核酸片段的定性分析。它是一种基于凝胶的技术，提供基于大小和电荷的核酸分子分离范围。在RNA电泳过程中，带负电荷的RNA通过凝胶向阳极迁移。简单地说，一个RNA分子的长度决定了它的迁移时间。然而，通过分子内碱基配对形成RNA的二级结构可能会延迟迁移，因此，建议在变性条件下进行RNA电泳。在琼脂糖凝胶上分离的总RNA显示出*的物种特异性条带模式。通常，在真核生物中，可以检测到包含28S和18S核糖体RNA（rRNA）的两条主要条带。当28S:18S rRNA比值为2或更高时，我们认为总RNA是高质量的。琼脂糖凝胶电泳相对便宜，容易获得，然而，由于缺乏标准化和客观性，MIQE指南不推荐使用琼脂糖凝胶电泳。此外，琼脂糖凝胶电泳需要大量宝贵的RNA样本，涉及危险化学品的处理，并不提供RNA定量的相关信息。
毛细管电泳
毛细管电泳可用于分离和量化RNA样本。与经典的凝胶电泳相比，这种电泳模式显著减少了不同类型核酸的分离时间以及试剂和样品的消耗。毛细管电泳可以提供RNA完整性和浓度的分析。RT-qPCR的性能受RNA完整性的影响，而PCR的效率一般不受影响。测定后RIN值大于5的总RNA被认为是质量良好，RIN值大于8的被认为是完整的总RNA。不同生物体和特定样本类型有特定RIN值要求和阈值水平。作为一种方便和客观的评估RNA数量和完整性的方法，该方法与MIQE指南理念一致，因此经常被推荐用于总RNA质量控制。
3. miRNA质量控制方法
RNA质量的测定也应用于其他方面，如microRNA（miRNA）表达谱分析。传统的分光光度法不适用于测定这些短的、非编码的RNA分子的浓度。RNA提取方法对于保留miRNA和小RNA组分是至关重要的。由于miRNA和小RNA的迁移类似于降解的总RNA，高浓度的这些物种类型可能因此产生低于预期的RIN值。RIN阈值的确定可能需要根据特定的提取方法进行调整。
4. 总结
在开展RT-qPCR和转录组测序等这种通过测定RNA转录水平来评估基因表达的实验时，我们需要对样本的总RNA质量进行严格把控。通过多种方法的结合，检测出可用于下游实验的RNA，样本质量质控通过后，后续的基因表达分析才是有意义的。
