磷酸化蛋白富集试剂盒的背景与应用！

磷酸化蛋白富集试剂盒的背景与应用！

一、背景

磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力,采用固定化金属螯合层析(IMAC)的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting,mass spectrometry,2D-PAGE和protein arrays等下游应用。

磷酸化是蛋白质中发生的翻译后修饰之一，可调节几乎所有的细胞内生物学事件，包括信号转导、蛋白-蛋白相互作用、蛋白稳定性、蛋白定位、细胞凋亡和细胞周期控制。鉴于磷酸基的短暂不稳定状态，检测蛋白磷酸化的变化可能是一项较困难的任务。此外，低磷蛋白丰度和开发效果不佳的磷酸化特异性抗体也使得磷蛋白检测存在困难。质谱(MS)技术的进展结合使用固定化金属亲和色谱(IMAC)进行的磷蛋白富集，提高了磷酸化蛋白质组的分离度。

蛋白样品的准备：

以下为由新鲜植物细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值低于6。

可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。

植物细胞裂解：

1、提取液制备：每500μl冷的裂解液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2、取植物细胞样本，在4℃，1000Xg条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3、用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4、每50-100mg细胞样本中加入500μl冷的蛋白裂解液，混匀后匀浆处理，然后在4℃条件下振荡15分钟。

5、在4℃，14000Xg条件下离心15分钟。

6、快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

植物组织蛋白提取：

1、裂解液制备：每500μl冷的提取液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。

2、取200mg植物组织样本，去除粗筋脉络等后尽可能剪碎，置于研钵中用液氮研磨。(没有液氮条件也可直接置冰上加入裂解液研磨即可)

3、研磨后加入500μl提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在4℃条件下振荡2-3小时。

4、在4℃，14000Xg条件下离心15分钟。

5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

二、柱平衡：

加入500μl洗柱液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500g力离心1分钟甩干吸附柱。

三、上样：

将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下自然流下或4℃下500g力离心1分钟甩干吸附柱。

四、洗柱：

加入300μl洗涤液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500g力离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。

五、洗脱：

加入500μl磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下自然流下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。

六、应用

用于家猫感染弓形虫后小肠蛋白的乙酰化及磷酸化蛋白组学分析研究：

对排弓形虫卵囊期间猫小肠的蛋白乙酰化组及磷酸化组进行研究,探讨弓形虫卵囊发育过程对猫小肠蛋白质修饰状态的影响。

方法：本研究利用非标记定量乙酰化蛋白组学技术,来研究弓形虫卵囊形成阶段猫小肠蛋白的乙酰化状态改变;基于同位素标记相对和定量（i TRAQ）磷酸化修饰蛋白组学技术,来研究弓形虫卵囊形成阶段猫小肠蛋白的磷酸化状态改变。

结果：研究结果表明,在弓形虫卵囊形成阶段猫小肠蛋白的乙酰化状态发生显著改变,共鉴定到2543条乙酰化肽段以及1357个乙酰化蛋白的2606个乙酰化位点。在感染弓形虫的猫小肠中有334条肽段的乙酰化发生下调,82条肽段乙酰化发生上调。亚细胞定位分析发现,发生差异的乙酰化蛋白质主要定位于细胞质、细胞核、线粒体和细胞外成分。

功能富集分析发现,这些发生差异的乙酰化蛋白富集于糖酵解/糖异生、柠檬酸盐循环和过氧化物酶体。=还鉴定到了一批新的弓形虫乙酰化蛋白,其中包括一种仅在卵囊或猫小肠上皮细胞表达的弓形虫乙酰化蛋白。在猫小肠蛋白的磷酸化修饰研究中,=共鉴定到4998条磷酸化肽段、1805个磷酸化蛋白及3497个磷酸化位点。

本研究中有82个蛋白的磷酸化状态被下调,1289个蛋白的磷酸化状态被上调。对差异磷酸化蛋白进行功能富集分析发现,差异磷酸化蛋白主要参与了肌动蛋白细胞骨架的重组、坏死以及免疫反应。

结论：本研究结果表明,弓形虫感染对猫小肠蛋白修饰状态具有广泛的影响。通过本研究,初步了解了弓形虫感染如何影响终末宿主小肠蛋白的乙酰化与磷酸化修饰状态。