活性氧检测试剂盒的背景与应用及操作步骤！

活性氧检测试剂盒的背景与应用及操作步骤！

一、背景

活性氧检测试剂盒是一种基于荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的试剂盒。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。在激发波长502nm，发射波长530nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

活性氧(ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

二、活性氧检测试剂盒操作步骤

1、装载探针

对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

2、原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)

细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到50～70%。

探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。

探针装载：吸除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，如，对于6孔板通常不少于1000μL，对于96孔板通常不少于100μL。37℃细胞培养箱内避光孵育20～30min。

细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

药物诱导：加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。

(可选)阳性对照：先用无血清培养基等1:1000稀释阳性对照(Rosup,50mg/ml)，加入细胞，一般37℃避光孵育20～30min可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。(如，HeLa细胞孵育30min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h)

3、收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)

细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。

探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。

探针装载：细胞收集后悬浮于加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液，使其细胞密度为1.0×106～2.0×107/mL，37℃细胞培养箱内避光孵育20～30min，每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

注：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。如，对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。

细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

药物诱导：将细胞悬浮于适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物中，或把细胞等分成若干份后再进行药物刺激，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。

(可选)阳性对照：先用无血清培养基等1:1000稀释阳性对照(Rosup,50mg/ml)，加入细胞，一般37℃避光孵育20～30min可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。(如，HeLa细胞孵育30min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h)。

4、检测

原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

5、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

三、应用

活性氧检测试剂盒可以用于微囊藻毒素-LR对中国仓鼠卵巢细胞的氧化应激和凋亡作用：

以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为模型,经MC-LR暴露后,检测CHO细胞活性的变化,及细胞内活性氧、抗氧化酶、脂质过氧化水平,线粒体膜电位,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性和细胞凋亡率的变化,从分子水平探讨MC-LR对CHO细胞的毒性作用,为阐明MC-LR的生殖毒性作用提供理论基础。

方法：

1、建立传代培养的CHO细胞模型。

2、用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测MC-LR对CHO细胞活性的影响：不同浓度的MC-LR(0μg/ml,1μig/ml,5μg/ml,10μg/ml15μg/ml)处理CHO细胞24h后,用MTT染色,测各组吸光度,计算细胞活性。

3、集落形成实验：用不同浓度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)处理CHO细胞24h,计算各组集落形成能力,评价MC-LR对单个CHO细胞增殖能力的影响。4.检测MC-LR对CHO细胞中过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影响：用不同浓度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)处理CHO细胞,24h后收集细胞,用2,7-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)法测定ROS,硫代酸(TBA)法测定MDA,可见分光光度法测定CAT。

4、线粒体膜电位检测试剂盒检测不同剂量MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m1)染毒24h后CHO细胞线粒体膜电位的变化。

5、Caspase-3底物切除法检测MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)对CHO细胞中caspase-3性的影响。

6、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测不同浓度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后细胞凋亡率的变化。

结果：

1、MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)处理CHO细胞24h后,MTT法检测结果显示随着毒素浓度升高,细胞形态逐渐改变,细胞活性逐渐降低。且与对照组相比,5μg/ml、10μg/ml和15gg/ml染毒组差异均有统计学意义(P<0.05)。集落形成实验中随着染毒浓度增加,集落形成能力下降,与上述结果一致,也证明MC-LR能抑制CHO细胞活性。