技术文章

一、实验目的
通过检测细胞内 DNA 含量的变化，检测外界干预手段对细胞生长周期的影响。

二、实验原理
细胞周期（cell cycle）：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期组成。G0/G1 期：二倍体细胞的 DNA 含量 (2N)。S 期：DNA 开始合成，这时细胞核内 DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之间。G2/M 期：DNA 复制结束成为 4 倍体（4N)。

碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 双链螺旋的碱基之间，产生红色荧光，并且荧光强度和所嵌入的核酸含量成正比。细胞周期检测时，首先用 RNA 酶将 RNA 消化排除影响，通过流式细胞术检测 PI 荧光强度直接反映细胞各时相的 DNA 分布状态，从而计算出各时相的百分率。

三、实验步骤
1. 细胞样品的准备：待各实验组细胞融合度达到 70%，用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入含有血清的完quan培养基终止消化，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000 g 左右离心 3 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬细胞，并转移到 1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
对于悬浮细胞：收集细胞到离心管内，1000 g 左右离心 3 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬细胞，并转移到 1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2. 细胞固定：加入 1 毫升冰浴预冷 70% 乙醇，轻轻吹打混匀，4℃ 固定过夜。1000 g 左右离心 3 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
3. 碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液，现配现用：

染色：每管细胞样品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃ 避光温浴 30 分钟。

流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长 488nm 波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射分析。

四、常见问题及解答

Q1：是否可以直接用乙醇固定细胞?

A：不可以，直接 70～75% 乙醇加入很容易导致细胞聚团现象，很难重悬成单细胞，影响固定效果，其至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是: 待细胞, 充分分散成单细胞后，缓慢地滴入无水乙醇中，使其终浓度为 70～75%7 醇。

Q2：细胞量过少，无法获得数据结果?

A：首先，要保证收集足够的细胞样品 (个人经验至少收集 100 万左右): 如果药物处理后。细胞死亡过多，应该降低药物浓度；其次，固定细胞时先用预冷的 PBS 重悬细胞，再逐滴滴入无水乙醇中；细胞清洗时，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片。最后，尽量采用尖底的离心管和水平的离心机，离心后尽量用移液枪吸走上清，不要倾倒，残留一点，不要吸完。

Q3：什么样的数据结果可以用?
A：G2/M 期细胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍，在直方图上形成一个 2 倍于 G1 信号峰的高斯峰；CV(变异系数) 表示峰的宽度，CV 值越小，峰形越好，最好是在 5% 左右，一般小于 10%
也被认可。RCS 最好是在 1～3，高于 5 则不被认可。RCS 高，说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大，可能由于处理细胞的时候 RNA 酶消化不好，或者是 PI 的浓度不佳造成的。

Q4：如何提高分辨率和精确度?
A：变异系数 (Coefficient of Variation，CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精确度。而样品 CV 值为样品固有，与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA 酶消化越充分，可以减少样本的 CV 值，提高 G0/G1 峰分辨率和精确度。