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蛋白质印迹故障排除指南

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2023/5/12 11:14:30

蛋白质印迹故障排除指南

Western Blot 是当今细胞和分子的常规方法之一 生物实验室。但是,分析蛋白质印迹结果可能会导致用户的问题,因为获得的数据可能没有定论。为了帮助您的下一次检测,我们将常见问题和解决方案放在一起 在一个指南中。

原因之一可能是抗体选择错误。尝试我们的网上商店,找到合适的一抗和二抗。如果您有任何其他问题,请咨询我们的。

阅读本故障排除指南,成为蛋白质免疫印迹专家:

  • 在蛋白质印迹中使用二抗的一般技巧

  • 无信号/低灵敏度

  • 高背景

  • 不特定的波段或点

无信号/低灵敏度

问题

未检测到分析物。

原因/补救措施

  • 检查使用的蛋白质量:布拉德福德测试;
    支链氨基酸法

  • 增加蛋白质浓度

  • 如果可能,使用抗原表达水平高的阳性对照

  • 使用新鲜的裂解缓冲液

  • 向样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂

  • 将样品储存在冰上 (4°C)

分析物在电泳过程中用完凝胶

  • 使用蛋白质分子量标准确保目标蛋白质(kDa)仍在凝胶内。

  • 缩短电泳时间

无需从凝胶转移到膜

  • 检查蛋白质转移是否成功:丽春红S染色

  • 使用上样对照(管家)来确保蛋白质的转移相等。

  • 延长传输时间

错误的印迹膜

聚偏氟乙烯

  • 需要用甲醇活化

  • 高结合能力(170 双 200 μg/cm2)

  • 与硝酸纤维素膜相比,更多背景

  • 适用于剥离缓冲液和重新探测。

硝基细胞使用

  • 结合能力低(80 双 100 μg/cm2)

  • 更少的背景

为您的样品选择合适的孔径:

  • 0.1, 0.2 或 0.45μm.(0.45μm孔径适用于大多数蛋白质(≥20kDa))

转移条件

  • 转印前去除凝胶和印迹膜之间的任何气泡。

  • 减少传输时间和/或电流(“过度传输”)。

阻止持续时间

缩短阻塞持续时间

  • 室温下1h

封闭剂的选择

抗原掩膜

  • 使用较低的浓度

  • 使用其他缓冲区

我们建议使用来自同一物种的5%正常血清作为二抗或不含IgG的BSA。

强力洗涤

  • 减少洗涤步骤的次数和/或持续时间

  • 3x 5 分钟(室温)

  • 降低洗涤剂的浓度

  • 0.1-0.5% 吐温 20

一抗错误

确保您选择的抗体适用于蛋白质免疫印迹(数据表)

孵育时间(一抗)

延长孵育时间

  • 4°C 过夜

抗体浓度低

  • 检查使用的抗体浓度。

  • 验证相关性

  • 从数据表中所述的较高浓度开始。然后逐步降低注意力。

二抗错误

检查二抗是否与所选的一抗结合(数据表)

辣根过氧化物酶(HRP)活性受到抑制

  • 不要在缓冲液中使用叠氮Hua钠。因为它抑制HRP(辣根过氧化物酶)偶联活性。

  • 不要使用甘油与ACS等级低于99,5%。因为它抑制HRP(辣根过氧化物酶)偶联活性。

  • 避免反复冷冻和解冻抗体溶液。

  • 准备小等分试样

抗体储存技巧

ECL试剂已过期

使用新鲜的ECL试剂

ECL试剂污染

使用新鲜的ECL试剂

曝光时间

  • 根据抗原表达水平的不同,暴露时间可能会有所不同

  • 通过小步骤增加暴露时间

高背景

问题

原因/补救措施

高抗原表达水平

降低蛋白质浓度

封闭剂的选择

  • 如果需要检测磷酸化蛋白质,请勿使用奶粉。

  • 一抗可能与酪蛋白发生交叉反应

  • 如果使用链霉亲和素/亲和素偶联物,请勿使用奶粉。

  • 牛奶含有内源性生物素

  • BSA和奶粉不适用于检测山羊、牛或绵羊的二抗。

  • 二抗可能与来自BSA或奶粉的牛免疫球蛋白发生交叉反应

我们建议使用来自同一物种的5%正常血清作为二抗或不含IgG的BSA。

孵育时间(封闭试剂)

延长孵育时间

  • 室温下1h

一抗浓度错误

  • 降低一抗浓度

  • 滴定

二抗浓度错误

  • 降低二抗浓度

  • 滴定

洗涤

曝光时间

  • 增加洗涤步骤的数量和/或持续时间

  • 3 x 5分钟 – 5 x 5分钟

  • 将吐温 20 添加到洗涤缓冲液中

  • (0.1-0.5%)

  • 使用振动筛

根据抗原表达水平的不同,暴露时间可能会有所不同

转印膜

  • 处理膜时使用镊子

  • 膜不应变干

检测试剂

降低底物浓度

不特定的条带或点

问题

原因/补救措施

蛋白质被 降解

  • 使用新鲜的裂解物

  • 将样品储存在冰上 (4°C)

  • 将蛋白酶抑制剂添加到样品缓冲液中

样品条件

  • 检测到错误的亚型

  • 翻译后修饰

  • 分子量变化,可能导致双条带

  • 如果可能,使用阳性对照

  • 如果可能,使用阴性对照

  • 样品和/或缓冲液的细菌污染

  • 准备新鲜样品或缓冲液

  • 使用去离子水

转印膜

  • 转印前去除凝胶和印迹膜之间的任何气泡。

  • 在封闭之前快速清洗膜,以去除任何残留的凝胶或SDS。

一抗

  • 验证一抗的特异性结合

  • 在对照实验中使用不含一抗的二抗。

  • 优化抗体浓度(滴定)。

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