Western Blot 是当今细胞和分子的常规方法之一 生物实验室。但是，分析蛋白质印迹结果可能会导致用户的问题，因为获得的数据可能没有定论。为了帮助您的下一次检测，我们将常见问题和解决方案放在一起 在一个指南中。
原因之一可能是抗体选择错误。尝试我们的网上商店，找到合适的一抗和二抗。如果您有任何其他问题，请咨询我们的。
阅读本故障排除指南，成为蛋白质免疫印迹专家：
在蛋白质印迹中使用二抗的一般技巧
无信号/低灵敏度
高背景
不特定的波段或点
无信号/低灵敏度
问题
未检测到分析物。
原因/补救措施
检查使用的蛋白质量：布拉德福德测试;
支链氨基酸法增加蛋白质浓度
如果可能，使用抗原表达水平高的阳性对照
使用新鲜的裂解缓冲液
向样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂
将样品储存在冰上 （4°C）
分析物在电泳过程中用完凝胶
使用蛋白质分子量标准确保目标蛋白质（kDa）仍在凝胶内。
缩短电泳时间
无需从凝胶转移到膜
检查蛋白质转移是否成功：丽春红S染色
使用上样对照（管家）来确保蛋白质的转移相等。
延长传输时间
错误的印迹膜
聚偏氟乙烯
需要用甲醇活化
高结合能力（170 双 200 μg/cm2）
与硝酸纤维素膜相比，更多背景
适用于剥离缓冲液和重新探测。
硝基细胞使用
结合能力低（80 双 100 μg/cm2）
更少的背景
为您的样品选择合适的孔径：
0.1， 0.2 或 0.45μm.（0.45μm孔径适用于大多数蛋白质（≥20kDa））
转移条件
转印前去除凝胶和印迹膜之间的任何气泡。
减少传输时间和/或电流（“过度传输”）。
阻止持续时间
缩短阻塞持续时间
室温下1h
封闭剂的选择
抗原掩膜
使用较低的浓度
使用其他缓冲区
我们建议使用来自同一物种的5%正常血清作为二抗或不含IgG的BSA。
强力洗涤
减少洗涤步骤的次数和/或持续时间
3x 5 分钟（室温）
降低洗涤剂的浓度
0.1-0.5% 吐温 20
一抗错误
确保您选择的抗体适用于蛋白质免疫印迹（数据表）
孵育时间（一抗）
延长孵育时间
4°C 过夜
抗体浓度低
检查使用的抗体浓度。
验证相关性
从数据表中所述的较高浓度开始。然后逐步降低注意力。
二抗错误
检查二抗是否与所选的一抗结合（数据表）
辣根过氧化物酶（HRP）活性受到抑制
不要在缓冲液中使用叠氮Hua钠。因为它抑制HRP（辣根过氧化物酶）偶联活性。
不要使用甘油与ACS等级低于99，5%。因为它抑制HRP（辣根过氧化物酶）偶联活性。
避免反复冷冻和解冻抗体溶液。
准备小等分试样
抗体储存技巧
ECL试剂已过期
使用新鲜的ECL试剂
ECL试剂污染
使用新鲜的ECL试剂
曝光时间
根据抗原表达水平的不同，暴露时间可能会有所不同
通过小步骤增加暴露时间
高背景
问题
原因/补救措施
高抗原表达水平
降低蛋白质浓度
封闭剂的选择
如果需要检测磷酸化蛋白质，请勿使用奶粉。
一抗可能与酪蛋白发生交叉反应
如果使用链霉亲和素/亲和素偶联物，请勿使用奶粉。
牛奶含有内源性生物素
BSA和奶粉不适用于检测山羊、牛或绵羊的二抗。
二抗可能与来自BSA或奶粉的牛免疫球蛋白发生交叉反应
我们建议使用来自同一物种的5%正常血清作为二抗或不含IgG的BSA。
孵育时间（封闭试剂）
延长孵育时间
室温下1h
一抗浓度错误
降低一抗浓度
滴定
二抗浓度错误
降低二抗浓度
滴定
洗涤
曝光时间
增加洗涤步骤的数量和/或持续时间
3 x 5分钟 – 5 x 5分钟
将吐温 20 添加到洗涤缓冲液中
(0.1-0.5%)
使用振动筛
根据抗原表达水平的不同，暴露时间可能会有所不同
转印膜
处理膜时使用镊子
膜不应变干
检测试剂
降低底物浓度
不特定的条带或点
问题
原因/补救措施
蛋白质被 降解
使用新鲜的裂解物
将样品储存在冰上 （4°C）
将蛋白酶抑制剂添加到样品缓冲液中
样品条件
检测到错误的亚型
翻译后修饰
分子量变化，可能导致双条带
如果可能，使用阳性对照
如果可能，使用阴性对照
样品和/或缓冲液的细菌污染
准备新鲜样品或缓冲液
使用去离子水
转印膜
转印前去除凝胶和印迹膜之间的任何气泡。
在封闭之前快速清洗膜，以去除任何残留的凝胶或SDS。
一抗
验证一抗的特异性结合
在对照实验中使用不含一抗的二抗。
优化抗体浓度（滴定）。
