为度生物 | 亲和层析介质选择指南

亲和层析是基于生物分子与其他配基分子之间（如抗原与抗体、酶与底物、激素与受体、核酸中的互补链、多糖与蛋白复合体等）的特异性吸附原理建立和发展起来的。通过介质上的配基与目标分子之间的特异性吸附来实现纯化目标分子的目的。由于这种特异性的作用力，亲和层析具有高度选择性、高活性回收等特点。

 将Protein A和Protein G等物质偶联在高强度交联琼脂糖上，广泛用于抗体的纯化。

抗体纯化工艺过程

抗体纯化亲和介质列表

应用案例

Plasmid系列填料纯化原理是利用配基的嗜硫吸附，适用于分离纯化闭环的超螺旋质粒DNA。

质粒DNA纯化亲和介质列表

 过渡态金属离子 （Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+）能够与电子供体，如N、S、O等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中会被水分子或阴离子占据，当蛋白质表面氨基酸残基（His）与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子就会与金属离子结合形成复合物，取代原先结合的水分子或阴离子，这样就能使蛋白质分子结合在固体表面。His标签蛋白的His和介质结合，由于蛋白质表面的氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而具体使用时根据金属配基的亲和力大小不同，选择不同的金属配基进行分离纯化。

★螯合离子（和His结合力）Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+，其中：Cu2+结合力强，Ni2+最'常用，Co2+结合力较弱而分辨率高。

His标签蛋白纯化亲和介质

     His标签蛋白纯化亲和介质是将金属离子（Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+）螯合在高强度交联的琼脂糖上制备而成的亲和介质。根据螯合方式不同，又分为IDA,IMAC,TED三种。

His标签蛋白纯化亲和介质对比

His标签蛋白纯化亲和介质列表

应用案例

His标签蛋白纯化亲和介质的清洗

His标签蛋白纯化亲和介质常见问题

（1）His标签蛋白不和介质结合

可能原因a：超声功率不合适（太大，蛋白碳化；太小，蛋白没有全部释放）

解决方法：改变超声功率或采用其它方法破碎细胞

可能原因b：样品或缓冲液不合适

解决方法：确保缓冲液中螯合剂，还原剂，咪唑浓度不是很高

可能原因c：His标签暴露不完全

解决方法：在缓冲液中加变性剂（4-8M尿素，4-6M盐酸胍），然后用IMAC介质纯化

可能原因d：His标签丢失

解决方法：必要时增加His的个数并确保正确表达，同时降低上样速度，确保足够的孵育时间

（2）His标签蛋白结合在介质上洗脱困难

可能原因a：洗脱条件太温和

解决方法：增加洗脱咪唑浓度或降低pH

可能原因b：蛋白沉积在介质上

解决方法：减少上样量，优化层析条件

可能原因c：非特异性结合

解决方法：缓冲液加2% Triton X-100和NaCl

（3）洗脱峰杂质多

可能原因：非特异性结合，清洗不彻'底，降解等

解决方法：纯化过程加蛋白抑制剂防止降解，上样完后要彻'底清洗，加一定的NaCl和咪唑减少非特异性结合

（4）使用几次，介质结合效率降低，柱效降低

可能原因：介质上沉积大量杂质等

解决方法：彻'底清洗，IDA/IMAC脱镍再生处理

     GST（谷胱甘肽转移酶）能特异的与谷胱甘肽结合，表现为酶和底物的作用原理，利用这个原理，将GST做成标签表达出融合蛋白，与谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合，从而纯化出目标蛋白。GST融合蛋白纯化的特点是：纯度高，纯化条件温和保持蛋白活性，促进蛋白可溶性表达等。

GST标签蛋白纯化亲和介质列表

应用案例

     丝氨酸蛋白酶纯化亲和介质，是将丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂对氨基苯甲醚偶联在琼脂糖微球Focurose FF和高强度交联的琼脂糖Focurose4FF制备而成，称为Benzamidine Focurose FF(LS)和Benzamidine Focurose 4FF(HS)。

丝氨酸蛋白酶纯化亲和介质列表

肝素亲和介质列表

    PS Focurose HPL是一种特定的亲和填料，适用于部分病毒、病毒样颗粒以及某些特定的抗原和蛋白的亲和层析纯化。

病毒，病毒/微生物抗原纯化亲和介质列表

PS Focurose HPL适用性

     预活化介质也称为亲和介质活化中间体，是在各种交联强度琼脂糖的基础上，通过不同的偶联方法键合上不同的活性基团（活性间隔臂）。通过活性基团可进一步偶联各种配基，用于制备其它介质（主要是亲和介质）及固定相应物质，用户可根据自己需求把待偶联的配基很容易地偶联上去，避免了前期接活性基团的繁琐工序。

预活化介质列表

应用案例

预活化介质的特点

★CNBr Focurose 4FF应用广泛，无需偶联间隔臂，直接偶联各种带氨基的生物大分子，多位点偶联，简单、灵活、快速、有效，能高效的维持生物分子的生物学活性及稳定性。

★NHS Focurose 4FF易与蛋白形成酰胺键，化学性质稳定。

★Epoxy Focurose 4FF应用广泛，偶联条件温和，偶联效率高。