生物实验中选择层析的方法

    实验者们在对目标蛋白的特性或样品成分不太了解时，可尝试以下几种不同的纯化方法：

一、使用zui通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广泛的介质如Superose、Sephacryl HR根据分子量将样品分成不同组份。

二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。

三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

    纯化大量粗品

    处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE截止，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一，提高回收率，缩短纯化周期。

     纯化硫酸氨样品

    硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，先用HiTrap HIC Test Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八种疏水介质中选择介质及*的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其他吸附性层析。

    纯化糖类分子

    固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麦等的凝集素，结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组分、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，可俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。

    纯化膜蛋白

    膜蛋白分离长使用去污剂使其保持活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白电荷相反者，以避免在作离子交换时蛋白竞争交换介质，藉此除去去污剂。非离子性去污剂可用疏水层析法除去。

    纯化单抗、抗原

    单抗多为IgG，来源主要是腹水和混合瘤培养上清夜。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Protein G和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步醇化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的栽量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose Hp或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。 疏水层析pheny1 Sepharose HP也很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。纯化IgG抗原zui有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来从蛋清里纯化IgY，结合量达100 mg纯IgY。

    纯化重组蛋白

    重组蛋白在设计、构建时应已融化入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合作粗分离。

    纯化包涵体蛋白

    包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或尿素中。高化学稳定性的Sepharose12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白质需要复性至蛋白的天然构象。Superdex75、Q Sepharose FF和pheny1 Sepharose FF 分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以使1M NaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收效率明显提高。

    包涵体蛋白固相复性

    将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白聚体的形成，所以复性锝率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。

    固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组胺酸融合蛋白；以及以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用。