外泌体纯化？miRNA定量？So easy！

背景：近年来，人们对外泌体和其他细胞外囊泡（ev）所携带的RNA和其他分子的重要性越来越感兴趣。因为在很多应用中，尤其是在外泌体作为诊断性生物标志物和治疗性载体的临床应用已经在逐渐发挥作用。关于外泌体的纯化及应用，小优之前就做过专题的系列软文及讲座，划到最底端可以回顾哦~

即使外泌体纯化的方法多种多样，但不同的样本以及不同的应用情况下，大家在选择纯化方式时，依然会有选择恐惧症。今天小优带大家针对外泌体内RNA分子研究的整套流程，进行一个梳理，有帮助的情况下请“一键三连”哦~

Tip1：对于从EVs中特异性分析RNA，必须通过过滤或离心去除残留的细胞、细胞片段和凋亡小体。否则，残留的细胞RNA数量远远超过游离RNA，对分析造成巨大的难度，即使是少量的细胞碎片也可以对无细胞液体的RNA谱产生非常显著的影响。

（1）在获取血清血浆样本时，首*行低速离心去除血细胞。采血后越早去除细胞材料，在体外产生的血细胞来源的囊泡的额外背景的风险就越低。

（2）对于所有其他生物液体（包含细胞上清），必须进行高重力离心步骤或过滤，以去除所有剩余的细胞、细胞碎片、凋亡小体等。这会显著减少细胞或基因组DNA和RNA的含量。

推荐使用0.8 μm过滤器孔径（或3000xg离心）将有效地排除细胞物质，包括血小板碎片，但仍保留绝大多数EVs，而使用0.2或0.45 μm过滤器（或离心，例如16000xg）将去除一些较大的囊泡。

Tip2：针对尿液等样本，富含干扰成分，可进行长短RNA的分离；并建议使用晨尿样本

尿液中可能含有各种代谢物，它们可能会干扰RNA分析，例如，使用RT-PCR或RNA-Seq。为了确保分离的RNA的最佳性能，我们建议分别分离长RNA和短RNA物种（分别大于或小于约200nt）。对于短RNA的分离，使用Reagent UI（cat:77900，QIAGEN）。

Tip3：膜亲和法纯化EVs，其整体表达谱更完整，且操作简单，便于下游RNA的一步分离

QIAGEN exoEasy 系列试剂盒使用基于膜的亲和结合步骤从无细胞生物液体中分离出外泌体和其他ev。该方法不根据大小或细胞来源来区分ev，也不依赖于特定表位的存在。而是利用囊泡的一般生化特征来进行外泌体的纯化，下游可进行粒径分析、WB、电镜、及RNA分析等。初次之外，升级的exoRNeasy系列可直接进行样本中外泌体RNA的纯化，减少移液步骤，得率更高。1h内即可完成纯化哦~

图注：The exoRNeasy Midi/Maxi Kit 纯化外泌体和总RNA分离在不到1小时内

Tip 4：miRNA纯化后定量，使用qRT-PCR结果更精准

常规的RNA浓度使用分光光度计测量260 nm（A260）处的吸光度来确定。然而，对于从EVs中获得的少量RNA，可能很难用光度法确定其数量。少量的RNA可以使用安捷伦®2100生物分析仪、定量RT-PCR或荧光定量法进行定量。当从特别小的样本（如激光显微解剖样本，或血浆或血清）中纯化RNA时，应使用qRT-PCR进行定量。RIN值通常也不能作为EVs（或总血浆或血清）中细胞游离RNA的RNA完整性的指标。

Tip 5：EVs（或总血浆或血清）中，内参需谨慎选择，或使用外参作为对照

在进行细胞、血液、组织microRNA检测时，我们常用选择U6做内参基因。不过在EVs中miRNA的内参，大家各有己见。除各自行摸索的内参外，选择添加外参也是一种常见的形式，其中cel-miR-39-3p被广泛的应用，将此RNA加入到样本中，进行共同纯化，可以检测提取、PCR等过程。
RNA Spike-In Kit, For RT（cat:339390，QIAGEN）是最新推出的一个参照试剂盒，其中包含两个部分：Box1：提前预混的UniSp2、 UniSp4 和 UniSp5，主要用于RNA纯化的对照。Box2：cel-miR-39-3p，用于cDNA合成对照。以上试剂盒兼容SYBR GREEN和probe方法的qPCR。

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