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肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是肿瘤微环境中一种可塑性异质细胞群体，占某些实体肿瘤的50%，TAMs通常表现出免疫抑制M2表型，导致预后不良。TAMs通过刺激血管生成，增加肿瘤细胞的迁移和侵袭，抑制抗肿瘤免疫引起恶性发展。由于TAMs的高度可塑性，将抗炎巨噬细胞极化为促炎巨噬细胞是一种很有前途的抗肿瘤方法。目前常用的策略是通过局部或全身给药来输送外源性物质，如免疫因子、单抗和免疫激动剂。然而，在不影响正常凝血的情况下，精确诱导肿瘤出血的新材料仍面临挑战。

近日，南京大学吴锦慧教授团队在 ADVANCED MATERIALS（IF=29.4）上发表了题为“Flagella of Tumor-targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy”的研究论文。他们通过基因工程技术构建了一种肿瘤靶向多鞭毛细菌(flhDC VNP)，从而实现了精确的肿瘤出血。flhDC VNP在肿瘤中定植，并在增殖过程中过度表达鞭毛。鞭毛促进肿瘤坏死因子TNFα 的表达，从而导致局部肿瘤出血。出血时渗入的红细胞使巨噬细胞暂时极化为M1亚型。在青蒿琥酯(artesunate，Arts)存在下，其与血红素(heme)形成一种络合物，不断产生活性氧(ROS)使暂时的极化转变为持续的极化。因此，肿瘤靶向细菌鞭毛可能为重新编程TAMs和改进抗肿瘤治疗开辟新的策略。

图1  触发局部出血和TAM重新编程的肿瘤靶向细菌的鞭毛示意图

FlhDC VNP和∆flhD VNP的构建及鉴定

研究团队首先在减毒沙门氏菌VNP20009(Vnp)中引入高表达flhDC质粒，构建flhDC VNP细菌。通过阿拉伯糖(abs816776)的诱导，flhDC VNP成功表达由超表达质粒编码的荧光蛋白tdTOMATO、鞭毛和flhDC蛋白。为了研究鞭毛是否可以稳定过表达，他们连续传代了持续表达flhDC蛋白的flhDC VNP，表明flhDC VNP的鞭毛过表达相对稳定。扫描电子显微镜观察，表明 flhDC VNP鞭毛的数量远远高于未经编辑的VNP。通过敲除细菌基因组中的flhD基因构建鞭毛缺陷沙门氏菌ΔflhD VNP，扫描电子显微镜观察表明ΔflhD VNP表面无鞭毛。为了研究鞭毛的数量对细菌的运动是否是必要的，研究者进行了琼脂封闭式Transwell试验。flhDC VNP能在2 h内迅速穿透琼脂，而VNP和ΔflhD VNP几乎不能穿透琼脂。在3D细胞组织中的进一步实验表明，flhDC VNP穿透更深。因此，这些结果表明，他们成功构建了稳定表达的flhDC VNP和ΔflhD VNP，且细菌的运动能力随着鞭毛数量的增加而增强。

图2  多鞭毛细菌的构建与表征

FlhDC VNP诱导肿瘤出血

为了研究鞭毛数量的增加是否会增加细菌在肿瘤中的积累，研究人员将等量的VNP，flhDC VNP和ΔflhD VNP静脉注入荷瘤小鼠体内，在不同时间取小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行细菌计数，结果所有细菌在肿瘤中的积聚随着时间的推移而增加。此外，在注射细菌72小时后，flhDC VNP在肿瘤中的积聚量是VNP和ΔflhD VNP的10倍。这些数据表明，鞭毛数量的增加有利于肿瘤内细菌的增殖。在其他器官中，由于免疫细胞的清除作用，细菌的分布呈现缓慢下降的趋势。

为了探究鞭毛数量的增加是否可以增加血液中炎性细胞因子的分泌，他们比较了静脉注射flhDC VNP、ΔflhD VNP和VNP后肿瘤坏死因子TNFα 的浓度随时间的变化。结果表明，注射后1h血液中TNFα 浓度最高，并且flhDC VNP刺激TNFα 分泌的作用明显高于ΔflhD VNP和VNP。由于肿瘤血管的低流速和高通透性，过量的炎症因子可能会破坏肿瘤血管。随着时间的推移，肿瘤出血加重，在注射细菌12h时，肿瘤内的红细胞浸润量达到最大。注射细菌后12h取材，苏木精伊红(H&E)染色。注射flhDC VNP的肿瘤含有最多的浸润性红细胞。这些数据表明，flhDC VNP在肿瘤内积聚，通过增加炎性细胞因子水平而导致肿瘤出血。

图3  细菌诱导TNFα 分泌增加并且诱导肿瘤出血

Heme与Arts反应形成能极化巨噬细胞的复合体

正常情况下，渗透的红细胞被巨噬细胞吞噬。在巨噬细胞内，红细胞分解为血红蛋白，血红蛋白被消化为血红素。然后，血红素通过HRG1从内体运输到巨噬细胞胞浆。血红素能与含有过氧化键的抗疟疾药物发生特异性反应，如Arts。当Arts被低价过渡金属络合物（血红素）激活时，弱过氧化键发生均质断裂产生ROS。研究人员发现，血红素和Arts结合产生了一种具有过氧化物酶活性的复合物。过氧化物酶可以催化过氧化氢产生羟基自由基，同样也可以增加细胞内ROS的产生。

ROS水平升高会影响巨噬细胞的表型。ROS通过MAPK信号通路、NF-kB信号通路、NOD样受体和改变线粒体膜电位促进促炎巨噬细胞极化。研究结果表明，Arts-血红素复合体显著增加巨噬细胞的促炎表型。促炎调节是通过改变线粒体膜电位来调节的。因此，红细胞与Arts形成复合体，通过改变线粒体膜电位和激活NLRP3炎性小体，增加巨噬细胞内ROS水平，极化TAMs。

图4  血红素heme与青蒿琥酯Arts反应产生ROS持续极化巨噬细胞

FlhDC VNP与Arts联合应用极化巨噬细胞并促进肿瘤炎症微环境

由于巨噬细胞在肿瘤中的占比高达50%，并且具有高度可塑性，因此研究团队进一步研究flhDC VNP和Arts联合给药后TAMs的表型变化。结果显示，flhDC VNP联合Arts显著增加了促炎TAMs的比例，降低抗炎TAMs的比例。巨噬细胞的促炎极化可能改变肿瘤的免疫微环境。对肿瘤的转录组分析显示，flhDC VNP和Arts可以上调多个炎症相关基因以及多种炎症信号通路、细胞趋化因子通路和免疫系统过程通路，如TNF信号通路、NF-κB信号通路和趋化因子信号通路。因此，flhDC VNP和Arts联合应用可使TAMs极化为促炎表型，增加肿瘤免疫细胞的浸润，从而使肿瘤免疫微环境从“冷瘤”转变为“热瘤”。

图5  FlhDC VNP与Arts联合给药肿瘤免疫微环境表征

FlhDC VNP联合Arts对不同肿瘤模型的抗肿瘤作用

最后，研究团队通过静脉注射细菌结合腹膜内注射Arts来评估flhDC VNP在CT26异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用。结果表明，当flhDC VNP与Arts联合作用时，Arts的抗肿瘤作用增强。此外，为了更好的模拟肿瘤生长环境，研究人员用原位结肠肿瘤模型来评估其抗肿瘤作用。结果同样证实flhDC VNP增强了Arts的抗肿瘤作用。进一步的研究表明，flhDC VNP联合Arts对CT26移植瘤、原位CT26结肠癌和化疗耐药黑色素瘤均有一定的抗肿瘤作用，并能增强TCR-T细胞治疗的抗肿瘤作用。

图6   FlhDC VNP联合Arts的抗肿瘤效果

综上所述，肿瘤靶向细菌鞭毛可能为重新编程TAMs和重塑肿瘤免疫微环境以改进抗肿瘤治疗开辟新的策略。此研究具有广阔的应用前景，并获得国家重点研发计划、国家自然科学基金的大力资助。

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[1] XuHH, Xiong SQ,Chen YY, et al. Flagella of Tumor-Targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-Associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy[J]. Mater. 2023, 2303357.

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