细胞端粒酶活性检测——细胞成瘤性检测
一、端粒
端粒（telomere）位于真核细胞染色体末端，其 DNA 序列高度保守。端粒可减少末端缩短，亦可避免相邻染色体末端融合，在细胞增殖及衰老等过程中发挥重要作用。人体细胞每分裂 1 次，端粒缩短 50～100 bp，当端粒长度缩短到伤害 DNA 的临界值而细胞又无法补偿此长度缩短时，染色体稳定性变差，最终导致细胞死亡、机体衰老。
二、端粒酶
端粒酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶和逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，可维持端粒长度（Greider and Blackburn 1989）。端粒酶以自身RNA为模板，合成端粒DNA，从而使细胞获得无限增殖。其主要由 3 部分组成[即人端粒酶RNA（humane telomerase RNA component, hTERC）、端粒酶协同蛋白（humane telomerase associated protein, hTEP1）及端粒酶逆转录酶（human e telomerase reverse transcriptase, hTERT）]，其中hTERT被认为是端粒酶活性表达的关键组分，hTERT编码的 mRNA 水平与端粒酶整体活性一致。因此，可以用hTERT亚基的mRNA水平基因表达量来衡量端粒酶活性。hTERT和hTERC对于端粒维持和延伸的催化活性是必要和充分的（Lingn er等, 1997; Weinrich等, 1997）。DKC1是端粒酶复合体的一个重要组成部分，属于协同蛋白之一，在正常端粒功能的维持、前体rRNA的加工、正常核糖体生物合成以及基因转录后修饰等过程中发挥重要作用。
三、端粒酶活性的组织特异性
端粒酶在细胞中的主要生物学功能是通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA，稳定染色体端粒DNA的长度。端粒酶的活性在真核细胞中可检测到，其功能是合成染色体末端的端粒，使因每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度得以补偿，进而稳定端粒长度。
然而，大多数人类体细胞并不主动表达这种酶。在人类研究中，一些常用于分析端粒长度的细胞类型是血淋巴细胞和其他单核细胞，通常称为外周血单核细胞（PBMC）。这些细胞被激活时能够上调端粒酶活性。端粒长度和端粒酶活性这两个因素都是在不同的分子水平上独立调节的，它们之间复杂的相互作用还不清楚，例如氧化应激、TPE和TERRA都会干扰它们。
端粒酶-酶复合物的高度保守和严格调控的催化亚基TERT通过RNA模板反向转录端粒六核苷酸来维持和恢复端粒长度（Smogorzewska and Delange, 2004）。然而，人体内只有生殖干细胞和癌细胞表达足够水平的端粒酶以维持端粒长度（Kim等, 1994）。人端粒酶以组织特异性方式表达，并在衰老过程中减少端粒酶阳性的细胞类型（Lin等, 2015；Young等, 2003）。人胚胎组织中，端粒酶活性高，并且随着年龄增长，端粒酶活性逐渐降低（肝脏组织除外）。在某些成人细胞如淋巴细胞、内皮细胞和成人干细胞中仍可检测到端粒酶活性。生殖细胞中的端粒酶活性也很高，因为需要确保后代的端粒足够长。而胚胎干细胞也具有端粒酶活性的特点，这是其能够在细胞培养条件下在体外持续生长的基础。
肿瘤发生过程中，端粒酶活性高度上调，在大多数癌症肿瘤组织中，端粒酶活性较高。这种活性升高的状态，使得端粒长度得以维持，即使在癌细胞中端粒长度很短，也能使细胞无限期生长。因此，端粒酶活性是细胞永生的重要先决条件。
四、检测意义
1、临床上：可检测是否有肿瘤
2、工业客户：间接考察细胞是否有成瘤的可能性
五、端粒酶活性检测的主要方案
1、直接检测端粒酶（蛋白及RNA的结合复合物）的活性，检测它是否可以延伸DNA模板，然后跑胶或者探针杂交，检测DNA延伸的长度，以此来判断端粒酶的活性高低。（TRAP法）
优缺点：该方法需要提取蛋白，操作较复杂，灵敏度不高；放射性同位素标记；重复性差、周期长等。
2、间接检测端粒酶（催化亚基的mRNA量）的活性。
优缺点：该方法灵敏度高，操作相对简便；但是在多数细胞中，端粒酶催化亚基的表达很难检测到。
六、翼和端粒酶活性检测
1、检测原理
双色荧光探针分别检测端粒酶催化亚基TERT基因mRNA和内参基因GAPDH mRNA。在进行样本检测时，同时检测阳性细胞293T和阴性MRC-5细胞做为对照，利用∆∆CT法计算样本中TERT基因的相对表达量。
2、检测结果展示
3、定量PCR扩增曲线
七、服务和产品
目前可提供试剂盒和样本送检服务。
主要参考文献：
唐珍,王含彦,郭冬梅.端粒（酶）对衰老及肿瘤的调节研究进展.中国现代医学杂志, 2018, 28(30):43-49.
Geraldine Aubert and Peter M. Lansdorp. Telomere and aging. Physiol Rev, 2008, 88:557-579.
J. R. Harris, V. I. Korolchuk (eds.), Biochemistry and Cell Biology of Ageing: Part I Biomedical Science, Subcellular Biochemistry 90, Chaper 9: Telomeres, Telomerase and Ageing. 221-308.
