二抗用于通过与荧光团或酶的偶联来可视化与靶标结合的一抗的定位。在选择哪种二抗*适合实验时，需要考虑多种因素，包括：
目标和宿主物种
靶标抗体类别
纯化和/或交叉吸附
结合
用于的应用程序
可用的成像设备
多路复用
是否需要三级检测系统
二抗总是针对特定物种的抗体提出。选择二抗时，应确保：
二抗针对与一抗宿主物种相同的物种进行。
二抗针对与一抗相同的免疫球蛋白类别（例如 IgG 或 IgM）进行检测。
您应确保二抗已以*认的方式纯化。最常见的纯化方法之一是通过蛋白A或G亲和色谱，其中蛋白A和G与色谱柱中的树脂结合并与免疫球蛋白特异性结合，同时洗涤血清中的其他蛋白质。
交叉吸附是指针对一系列非靶蛋白和免疫球蛋白筛选二抗。二抗通过含有固定化非靶蛋白的色谱柱，只有二抗没有交叉反应性通过色谱柱。此步骤减少了脱靶结合，从而减少了免疫化学实验中的背景染色。
首先要做的是让自己了解可用的检测设施，因为这将决定哪种偶联物可能是*好的。三种主要的检测系统包括：
增强型化学发光（ECL）：使用暗室和X射线胶片或使用基本的凝胶成像系统捕获。
显色检测：使用标准扫描仪捕获。
荧光检测：使用**的凝胶成像系统捕获。
有关不同检测系统的概述，请参见图1和表1。
图1.可用于蛋白质免疫印迹的检测方法概述
检测方法 | 二级偶联物 | 基质 | 考虑 |
增强型化学发光 （ECL） | 辣根过氧化物酶 | 基于鲁米诺的ECL检测解决方案 | 基于 HRP 的系统通常更灵敏且更易于使用 |
碱性磷酸酶 （AP） | 基于吖啶和1,2-二氧杂环丁烷的ECL检测解决方案 | ||
显 色 | 辣根过氧化物酶 | 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺 （TMB）、氯-1-萘醇 （4CN） 或 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB） | 通常灵敏度低于ECL，更难使用。允许多路复用。 |
碱性磷酸酶 （AP） | 硝基蓝四唑（NBT）或5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP） | ||
荧光 | 荧光基团（例如Alexa Fluor 680） | 那 | 多路复用和信号的持续时间可以比 ECL 更长 |
表 1.蛋白质免疫印迹检测方法摘要
增强型化学发光 （ECL） 利用辣根过氧化物酶 （HRP） 或碱性磷酸酶 （AP） 偶联的二抗来催化产生光的反应。这是通过过冷CCD传感器或X射线胶片检测的，可以可视化印迹。
HRP偶联次级因其即时信号生成和比AP偶联次级更高的灵敏度而被*广泛使用。使用AP偶联副反应时的另一个考虑因素是它们与磷酸盐缓冲液不兼容。HRP被叠*化钠（一种常用的防腐剂）抑制，因此不应与含有NaN的溶液一起使用3.
由于仅发射单一波长的光，因此不可能进行多重检测，除非蛋白质靶标以不同的分子量存在，从而可以在同一膜上同时探测多个靶标（例如见图2）。如果多个靶标的分子量相似，则需要剥离并重新探测印迹。
图2.使用抗体检测不同分子量靶标的ECL示例。使用小鼠单克隆抗NFL抗体（HB6433）和小鼠单克隆抗GAPDH（HB9177）探测从各种组织裂解物转移的蛋白质的膜。使用与HRP偶联的山羊抗小鼠多克隆抗体完成可视化。由于NFL和GAPDH的分子量不同，这使得多路复用变得容易。NFL和GAPDH的不同信号强度需要不同的曝光时间，这意味着每个目标都需要单独的面板。
显色检测利用HRP和AP偶联抗体催化反应，导致沉淀到膜上的有色最终产物。HRP的常见底物有：
3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）：产生具有高信噪比的蓝色产品
氯-1-萘醇（4CN）：产生紫蓝色产品。但是稳定性和灵敏度的问题
3,3'-二氨基联苯胺（DAB）：产生棕色产品，可使用金属离子增强。但是稳定性有问题。
AP 的常见基板有：
硝基蓝四唑（NBT）/5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP）：产生强烈的紫色产品，耐褪色。
AP反应可以通过与酸性溶液孵育来停止，因此允许与不同颜色的反应产物进行多重反应。然而，AP共轭次级器件通常不如HRP检测系统敏感，因此使用频率要低得多。HRP被叠*化钠（一种常用的防腐剂）抑制，因此不应与含有NaN的溶液一起使用3.
荧光检测利用荧光团偶联的二抗来检测蛋白质条带。由于PVDF在较低波长下自发荧光，用于WB检测的荧光团往往具有高度红移。ICC/IHC和WB中常用的荧光团列表详见表1。请参阅成像系统规格，查找荧光团与激发/发射波长兼容的组合。
与ECL相比，荧光检测的灵敏度较低，但通过使用具有足够不同的激发/发射波长的荧光团可以轻松进行多重检测。随着时间的推移，荧光信号也比ECL信号更稳定，允许轻松重新成像，同时比ECL检测变化更小，因为它不依赖于可能受多种因素影响的酶促反应。
免疫组织化学和免疫细胞化学利用荧光或显色介导的检测。方法之间的选择将取决于样品制备、实验目标和设备可用性（概述见表2和图3）。
检测方法 | 二级偶联物 | 优势 | 弊 |
显 色 | 辣根过氧化物酶
碱性磷酸酶 （AP） | 通过信号放大实现更高的灵敏度
最终产品稳定性更高，允许更长的载玻片存储时间 | 更耗时
更难多路复用 |
荧光 | 荧光基团（例如Alexa Fluor 488或DyLight 594） | 轻松多路复用
更快的实验方案
高动态范围 | 信号仅在几天内稳定
某些组织中可能存在自发荧光问题。
荧光团可以光漂白 |
表 2.免疫组织化学和免疫细胞化学检测方法概述。
图3.可用于免疫组织化学和免疫细胞化学的检测方法概述
荧光介导检测因其高度的灵活性和易于多路复用而非常受欢迎（例如参见图4）。这种易于多路复用也使荧光检测适用于共定位蛋白的分析。为免疫组织化学和免疫细胞化学选择荧光团/荧光团对的第一步是检查将用于成像的显微镜的规格。宽视场显微镜通常只配备有限的激发和发射滤光片，这将限制荧光团的选择，而共聚焦显微镜通常受到可用于激发的激光通道数量的限制。激发和发射滤光片的激发和发射波长范围需要与荧光团的激发和发射光谱重叠。有关IHC/ICC中常用荧光团（包括复染剂）的列表，请参见表3。
图4.使用荧光检测的免疫细胞化学示例。小鼠单克隆抗NFL抗体（HB6433）与DyLight 488偶联多克隆山羊抗小鼠二抗配对，用于检测利用DAPI（HB0747）作为复染剂的培养大鼠神经元中的神经丝，以可视化DNA。
Dye | Maximal absorbance wavelength (nm) | Maximal emission wavelength (nm) | Visible Colour |
Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | Blue |
Hoechst 33342 | 350 | 461 | Blue |
Hoechst 33258 | 352 | 461 | Blue |
DyLight 350 | 353 | 432 | Blue |
DAPI | 358 | 461 | Blue |
DyLight 405 | 400 | 420 | Blue |
Alexa Fluor 405 | 401 | 421 | Blue |
Alexa Fluor 430 | 433 | 541 | Green / Yellow |
EGFP | 488 | 507 | Green |
Cy2 | 489 | 506 | Green |
FITC | 492 | 520 | Green |
DyLight 488 | 493 | 518 | Green |
Alexa Fluor 488 | 496 | 519 | Green |
Alexa Fluor 532 | 532 | 553 | Yellow |
Cy3 | 550 | 570 | Yellow |
Alexa Fluor 546 | 556 | 573 | Orange |
Alexa Fluor 555 | 555 | 565 | Orange |
DyLight 550 | 562 | 576 | Orange |
TRITC | 557 | 576 | Orange |
Alexa Fluor 568 | 578 | 603 | Orange / Red |
Cy3.5 | 581 | 594 | Orange / Red |
mCherry | 587 | 610 | Red |
Texas Red | 589 | 615 | Red |
Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Red |
DyLight 594 | 593 | 618 | Red |
Alexa Fluor 610 | 612 | 628 | Red |
Alexa Fluor 633 | 632 | 647 | Far Red |
DyLight 633 | 638 | 658 | Far Red |
Alexa Fluor 635 | 633 | 647 | Far Red |
DRAQ5 | 646 | 697 | Far Red |
Alexa Fluor 647 | 650 | 665 | Far Red |
Cy5 | 650 | 670 | Far Red |
DyLight 650 | 652 | 672 | Far Red |
Alexa Fluor 660 | 663 | 690 | Far Red |
Cy5.5 | 675 | 694 | Far Red |
Alexa Fluor 680 | 679 | 702 | Near Infrared |
IRDye 680 | 680 | 694 | Far Red |
IRDye 700 | 680 | 697 | Far Red |
DyLight 680 | 692 | 712 | Near Infrared |
Alexa Fluor 700 | 702 | 723 | Near Infrared |
Cy7 | 743 | 767 | Near Infrared |
Alexa Fluor 750 | 749 | 775 | Near Infrared |
DyLight 755 | 754 | 776 | Near Infrared |
IRDye 750 | 766 | 776 | Near Infrared |
DyLight 800 | 777 | 794 | Near Infrared |
Alexa Fluor 790 | 784 | 814 | Near Infrared |
IRDye 800RS | 770 | 794 | Near Infrared |
IRDye 800CW | 778 | 786 | Near Infrared |
表 3.荧光免疫组化和免疫细胞化学常用的一些荧光团和复染剂总结
通过使用具有不同激发/发射光谱的成对荧光团来实现多路复用。在选择荧光团对时，确保它们没有重叠的激发/发射光谱至关重要（参见图5，了解用于多重检测的荧光团成功组合的示例）。如果荧光团的发射光谱重叠，则通道可能会渗入另一个通道，从而难以分辨来自哪种抗体的信号。虽然一些**的分析软件能够纠正这一点，但仅使用一个荧光基团的对照通常很有帮助，以便可以轻松检测渗漏。
图 5：用于多重实验的合适荧光团组合示例。激发和发射光谱之间的重叠最小，这意味着成像时信号不太可能在通道之间渗漏。
显色检测利用碱性磷酸酶（AP，使用 3-氨基-9-乙基咔唑 （AEC） 作为底物）或辣根过氧化物酶（HRP，使用 3,3' 二氨基联苯胺 （DAB） 作为底物）介导的反应催化，导致有色底物沉积在组织切片上。由于这种彩色基材不会降解，这意味着载玻片可以保存数月而不会明显损失信号强度。由于酶反应充当扩增步骤，显色检测具有很高的灵敏度，但是除非靶标位于不同的细胞类型或位置，否则很难进行多重检测。在这种情况下，可以使用具有不同反应产物的底物成功多重。
当靶标以低丰度表达或其检测存在其他问题时，一种可能性是使用三级检测系统。这些利用链霉亲和素和生物素之间的*高亲和力，在免疫化学过程中增加了另一个步骤。三级检测使用生物素偶联的二抗，然后由荧光团或酶偶联的链霉亲和素结合。这增加了一个额外的扩增步骤，因此在以前使用其他检测方法的实验不成功的情况下非常有用。
