在细胞实验中，我们通常通过冻存的手段让细胞代谢变得缓慢，从而达到长期保存或保种的目的，以供后续实验的使用，那么如何让细胞“冻”起来使之不变与永恒逐渐成为一个热门话题，接下来一起来探究一下吧！
【低温储存】
随着细胞被冷冻至冰点以下，悬液中冰晶和溶质的浓度有所增加。如果冷却过程中，胞内水分可以渗出细胞，则可以减少胞内冰晶。通常1℃/min的降温速度可以促进此过程。但是，水分的丧失会导致细胞收缩，当这种收缩达到一定程度，又会导致细胞活性的剧烈下降。冷冻保护剂，如甘油或者二甲基亚砜（DMSO，货号：D2650），可以缓解这种效应。细胞冻存的标准程序是在含有冷冻保护剂的培养基中，将细胞缓慢冷冻至–70℃，然后将冻存管转移到液氮中以保持低于–130℃的环境。
【冻存液】
5%-10%的甘油和DMSO是最常见的冻存保护剂。虽然DMSO对细胞有毒性，但是与甘油相比，其渗入细胞的速度更快，而且冻存重复性更好（而且细胞复苏效率更好）。但是，DMSO一方面会导致某些细胞（如HL-60早幼粒细胞）分化，另一方面对某些细胞（如HBE4-E6/E7肺上皮细胞）的毒性也过大。对于这些细胞，则应使用甘油。甘油可以通过高压蒸汽灭菌，而DMSO只能通过过滤除菌。DMSO或者甘油至少应达到试剂级（或者更高级别，如细胞培养级），并且分装，避光保存。
【冻存管】
冻存管材质分为两种：玻璃或者塑料。玻璃管更难操作，但更适合珍贵细胞的长期保存，而且一旦适当密封，其安全性也更高。
【程序降温盒】
有很多方法可以实现1℃/min的降温速度。电脑控制的可编程电子降温系统是很好的方式，可以精确保持降温速度。
比较经济的方式是将冻存管放置于冻存盒中，在低于–70℃的冰箱中冻存24小时。已有一些商业化冻存盒产品能够非常接近1℃/min的理想降温速度。或者可以将冻存管放置于壁厚大约15mm的1L容积的聚苯乙烯盒子中，并填充入纸、棉绒或者泡沫起到隔热的作用。
【液氮罐冻存】
长期保藏所需要的超低温（低于 -130℃）环境，可以使用低温冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。液氮储存分为两种方式：将冻存管浸入液氮中或者悬于液氮液面以上的蒸气中。液体体系需要更多的液氮，后期维护简单，但是液氮有可能进入密封不严的冻存管中，并在细胞复苏时发生冻存管爆炸。
因此，强烈建议保存在液氮蒸气中。液氮蒸气会在罐内产生一个垂直的温度梯度。液氮底层为-196℃，而上层温度会受到液氮余量和液氮罐敞开时长的影响。为保证储存安全，请确保罐中液氮充足，以使上层温度低于-130℃。所有的储存系统都应配备温度报警装置。
【冻存程序】
以下程序适用于大多数细胞，如果必要，可以适当调整。冻存培养基的配方请参考其细胞说明书。
1.冻存前先检测细胞是否受到细菌、真菌、支原体和病毒的污染。通常冻存后10-14天才能得到污染检测结果，如果确定有污染，应将该细胞销毁。
2.冻存培养基由wan全培养基和5% DMSO（sigma D2650）组成。由于DMSO的溶解会放热，所以不能向细胞悬液中直接加入未稀释的DMSO。
3.以温和速度（125g×10 min）离心收集细胞，并以1×10*6-5×10*6活细胞/ml的密度重悬细胞。继续培养细胞直到复苏后细胞活性得以确定。
4.在冻存管上标记好细胞名称，编号和冻存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml细胞悬液（视冻存管体积）并密封。
5.室温条件下，将细胞在冻存培养基中平衡15-40 min（勿超）。这段时间中，可以将细胞悬液等分加入冻存管中。40min后，细胞活性可能会受到DMSO的影响而下降。
6.将冻存管置于已预冷至4℃的程序降温盒，并将降温盒置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少24小时。或者，使用已预冷至4℃的可编程电子降温系统以1℃/min的速度将冻存管降温至-40℃以下，然后迅速降至-130℃。
7.将冻存管迅速转移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常，冷冻的细胞会以10℃/min的速度升温，一旦达到-50℃以上，细胞会剧烈受损。
8.记录冻存位置和过程细节等信息。
9.置于-130℃ 24小时后，取出一只冻存管并复苏，以测定细胞活性和是否污染。
本期内容：如何让细胞“冻”起来？
下期内容：细胞实验中为什么要“慢冻快融”呢？
