高效色谱柱筛选
尿嘧啶和黄嘌呤，即咖啡因、可可碱和茶碱，是一组在各种生物过程和人类消费中起重要作用的有机化合物[1-3]。这些分子属于杂环化合物，其特点是含有碳原子和氮原子的环状结构。尿嘧啶是 RNA(核糖核酸)的基本组成部分，RNA 是形成遗传密码并参与蛋白质合成的基本核碱基之一。另一方面，黄嘌呤、咖啡因、可可碱和茶碱是一类结构相似但生物效应不同的生物碱[1-3]。这些黄嘌呤存在于各种植物中，是一种众所周知的兴奋剂，可以穿过血脑屏障，影响中枢神经系统。在 RP(反相色谱)[1-3]条件下(SN_802_2023)， LC(液相色谱)可分离生物碱。
超临界流体色谱(SFC)是一种使用超临界二氧化碳(CO2)作为流动相的基本成分的色谱技术。这种状态的二氧化碳被称为超临界，它具有独特的特性，如高扩散系数和低粘度，使其成为分离和分析化合物的绝佳溶剂。与传统色谱方法相比，SFC 提供了许多优势，包括更快的分析时间，更低的溶剂消耗和分离的差异选择性。此外，与 RP-LC 相比，SFC 代表了一种正交技术，为各种分析挑战提供了互补的分离能力。
在 SFC 中，色谱柱筛选包括测试不同的固定相，以找到最适合特定分离任务的固定相。固定相是色谱系统的重要组成部分，因为它直接影响色谱的选择性。不同的固定相具有不同的化学功能和与分析物的相互作用，使它们或多或少地选择特定的化合物。通过筛选和选择合适的色谱柱，可以优化分离条件，以获得更好的目标分析物的分辨率和灵敏度。
本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 仪器对尿嘧啶、咖啡因、可可碱和茶碱混合物进行平行柱筛选，随后转移到制备的 Sepiatec SFC-50。
设备
Sepiatec SFC-50 instrument
Sepmatix 8x SFC instrument
PrepPure Silica, 5μm, 250 x 10mm
PrepPure Diol, 5μm, 250 x 10mm
PrepPure Silica, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure Diol, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure Amino, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure 2-EP, 5μm, 250 x 4.6mm
Reprosil 4-EP, 5μm, 250 x 4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
PrepPure PEI, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure CBD, 5μm, 250 x 4.6mm
Cyano, 5μm, 250 x 4.6mm, (Dr. Maisch GmbH)
试剂和材料
二氧化碳(99.9%)
甲醇(≥99%)
尿嘧啶(99% + %)
可可素(99%)
咖啡(99%以上)
茶碱(99%)
实验
样品制备：
在 50/2.5mL 甲醇/水混合液中，40℃ 下用超声水浴溶解 0.05g 尿嘧啶，0.07g 咖啡因，0.055g 可可碱，0.085g 茶碱。
Sepmatix 8x SFC 筛选运行条件：
流动相：A =二氧化碳：甲醇
流速：3ml /min(每柱)
流动相条件：
0-0.5min：5% B
0.5-8.0min：5 - 50%
8.0-9.4min：50%
9.4-9.5min：50 - 5%
9.5-10min：5% B
检测：紫外扫描波段：200nm - 600nm
筛选运行是自动开始的。使用流量控制单元将流量设置为每通道 3mL/min，并平衡色谱柱。自动进样(V=5 μL)，开始平行筛选(运行时间=10min)。背压调节器设置为 150bar，柱箱加热至 32°C。
SFC-50 运行条件：
流动相：A =二氧化碳；B=甲醇
流动相条件：等度运行条件
检测：紫外波长 270nm
SFC 柱在规定的流速下条件预热 3 分钟，使用定量环自动注入样品并开始运行。背压调节器设置为 150bar，柱箱加热至 40°C。
结果与讨论
用 Sepmatix 8x SFC 筛选色谱柱：
为了确定样品的最佳分离选择性，进行了不同色谱柱的筛选。使用 Sepmatix 8x SFC 仪器可以高效地同时筛选8个色谱柱。因此，最佳选择性可以在很短的时间内确定。为此，使用了 8 种不同的固定相:硅胶、二醇基、氨基、氰基、2-EP、4-EP、PEI 和 CBD，图1显示了筛选的结果。
▲图1：Sepmatix 8x SFC 仪器筛选结果。从左到右依次为:硅胶、氨基、氰基、二醇基；下从左至右依次为：2-EP、4-EP、PEI、CBD 柱；运行时间=10分钟
用分辨率(R)来衡量色谱方法在色谱图中分离和区分两个相邻峰的能力，它量化了分析物相互分离的程度。表 1 显示了 4 组分分离的分辨率值。使用 Sepmatix 软件和以下公式自动确定：
其中tR1 和 tR2 代表 组分 1 或组分 2 的保留时间
W1 和W2 代表分量1或分量 2 峰高一半处的宽度
在处理复杂的混合物时，分辨率尤其重要，因为它确保每个分析物都被很好地分离，并且可以准确地识别和定量。分辨率为 1 表示峰值根本没有被分解，基本上是合并的，而更高的分辨率值表示峰值之间的分离更好。在使用过程中，分辨率至少应达到 1.5，才能以适当的定量和鉴定分析物。
色谱柱 | R1 | R2 | R3 |
硅胶 | 1.57 | 4.18 | 3.79 |
氨基 | 5.42 | 1.26 | 4.44 |
氰基 | 未分离 | 3.35 | 1.69 |
二醇 | 3.92 | 5.1 | 2.29 |
2-EP | 3.62 | 2.72 | 未分离 |
4-EP | 9.46 | 2.87 | 未分离 |
PEI | 9.93 | 1.86 | 10.8 |
CBD | 5.01 | 1.27 | 4.51 |
表1：SFC 不同筛选条件下的分辨率值
R 值的筛选和评价表明，硅胶、二醇基和 PEI 相对样品的分离选择性最好。二醇基在运行时间和分辨率方面表现出最佳性能。硅胶柱上的分离并不完全是茶碱和咖啡因的基线分离。PEI 相的运行时间相对较长，因为样品分子的位阻较大。表 2 为洗脱顺序，这是通过测定的光谱和组分的单独进样来确定的。与其他相相比，硅胶显示出不同的洗脱顺序。对于氰基、2-EP 和 4-EP，不能完全确定洗脱顺序。
色谱柱 | 洗脱顺序 | ||
硅胶 | 茶碱，咖啡因，尿嘧啶，可可碱 | ||
氨基 | 咖啡因，茶碱，可可碱，尿嘧啶 | ||
氰基 | 咖啡因和茶碱的双峰，可可碱，尿嘧啶 | ||
二醇 | 咖啡因，茶碱，可可碱，尿嘧啶 | ||
2-EP | 咖啡因，茶碱，可可碱和尿嘧啶的双峰 | ||
4-EP | 咖啡因，茶碱，可可碱和尿嘧啶的双峰 | ||
PEI | 咖啡因，茶碱，可可碱，尿嘧啶 | ||
CBD | 咖啡因，茶碱，可可碱，尿嘧啶 | ||
表2：SFC 不同色谱柱筛选条件下的洗脱顺序
将开发方法通过 SFC-50 放大：
由于二醇基取得了最好的结果，因此选择了 5μm, 250 x 10mm 的 PrepPure 二醇基进行 Sepiatec SFC-50 方法放大制备。由于通过堆叠注射法纯化混合物的效率明显高于多次梯度注射法，该方法是在等度运行条件下实施的，这是使用堆叠进样的要求。在等度条件下，样品只能在低甲醇含量下分离(见图2，下)。在高甲醇浓度下，由于流动相的高洗脱强度，尿嘧啶、咖啡因、茶碱和茶碱是不可分离的(见图2，上)。
▲图2：使用 PrepPure Diol 5 μm, 250 x 10mm 色谱柱分离样品。上:流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃，270nm, 33% B，进样量= 0.09 mL，运行时间= 4 min；下:流量= 20 mL/min 150 bar 40°C, 270 nm, 12%甲醇，0.09 mL，运行时间= 5 min
改变压力和温度可以优化分辨率。最佳分离条件为 40℃ 和 150bar。
图 3 为图 2(下)实验条件下的堆叠进样情况，堆叠时间为 2.42min，因此每 2.42min 进样一次。在这种情况下，由于每次额外注入节省了平衡时间，因此提高了产能。
为了更有效的多次分离，可以使用硅胶填料。使用 34% 的甲醇作为改性剂，将堆叠时间缩短至 2.15min。与二醇基相比，硅胶填料在 100bar 下表现出更好的性能。然而，在 1.5 的分辨率下，咖啡因和茶碱并不能获得理想的基线分离。由于硅胶的极性比二元醇高，为了快速洗脱，必须增加改性剂的含量，但这也导致溶剂消耗增加。
结论
在本文中，使用 Sepmatix 8x SFC 进行柱筛选，并将开发结果转移到 Sepiatec SFC-50 进行放大。在色谱参数分辨率和运行时间方面，二醇基表现出最好的效果。对于二醇基，根据筛选结果，在 Sepiatec SFC-50 仪器上采用 250 × 10 mm 柱进行等度堆叠进样。作为比较，开发了另一种用于硅胶填料的方法，但分辨率值略差。
这种分离表明，要想在 prep-SFC 中获得一个好的分离方法，事先通过柱筛选确定最佳选择性是很重要的。然后，该方法可以在 prep-SFC 上简单实现，并进行了优化。最理想的是，该方法在等度条件下应用，以最大限度地提高产量。
每次注射后的叠加紫外信号表明该方法具有良好的再现性(图3和4，下面)。垂直线描述了收集相应分数的时间窗口。
▲图3：堆叠进样与二醇柱分离。流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃，270 nm, 12% B，进样量= 0.12 mL；堆叠时间:2.42 min，注射次数：8次；上图：最终色谱图；下图为各注射剂的紫外信号叠加图
▲图4：堆叠进样与硅胶柱分离。流速= 16 mL/min, 100 bar, 40℃，270 nm, 34% B，进样量= 0.09 mL；堆叠时间:2.15 min，注射次数：7次；上图：最终色谱图；下图：分别在254 nm和270 nm处注射的叠加紫外信号
参考文献
https://doi.org/10.1093/chromsci/46.2.144
DOI: 10.1021/jf030817m
DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.11.013
DOI: 10.1016/j.saa.2004.03.030
Laboratory Chromatography Gμide, ISBN 3-033-00339-7, by Büchi Labortechnik AG (Switzerland)
