乳酸脱氢酶实验操作方法

乳酸脱氢酶实验原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗D-LDH抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗D-LDH抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的D-LDH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

乳酸脱氢酶组成及试剂配制

1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。 　　

2. 标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。 　　

3. 样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。 　　

4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。 　　

5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 　　

6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 　　

7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 　　

8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 　　

9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 　　

10. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

乳酸脱氢酶操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。 　　

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。 　　 　　

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。 　　

3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。 　　

4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。 　　

5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。 　　

6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。 　　

7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 　　

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

计算：以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。 　　

2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 　　

3. 一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 　　

4. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。 　　

5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。 　　

6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 　　

7. 底物请避光保存。