本文要点：血液循环系统功能失调通常会导致肢体和重要器官的急性或慢性缺血，造成高残疾率和死亡率。虽然传统的断层成像技术在循环系统疾病诊断方面表现出色，但在实时和精确的血液动力学评估方面仍存在许多限制。最近，第二区域近红外（NIR-II，1000-1700nm）荧光成像由于其高时空分辨率和实时特性的优势，引起了人们对体内监测和追踪各种生物过程的极大关注。在这里，我们利用NIR-II成像通过聚集诱导发光荧光聚合物（AIE纳米造影剂，AIE NPs）进行血液循环评估。得益于AIE NPs具有较长的激发波长、增强的吸收性能、在NIR-II区域更高的亮度以及更广泛的优化成像窗口，我们通过单一的NIR-II成像模式实现了对小鼠血液循环的多方向评估。因此，我们的研究为进行准确的血液动力学评估提供了一种荧光造影剂平台。近红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS
为了提高在生理环境中的液相分散性和生物相容性，使用表面活性剂Pluronic F-127封装AIE发光体，制备了BBT-C6T-DPA-OMe NPs（图1a）。动态光散射（DLS）结果显示AIE NPs呈均匀的球形形态，直径约为80 nm（图1b）。透射电子显微镜（TEM）也证实了这一点。BBT-C6T-DPA-OMe NPs的吸收和发射波长都延伸到了NIR-II光谱范围，使其非常适合进行体内高清晰度荧光成像（图1c）。值得注意的是，BBT-C6T-DPA-OMe NPs的ΦPL值（0.42%）相对于单个分子（0.39%）有所提高，这受到了AIE特性的影响（图S3和S4）。此外，持续激光照射下，AIE NPs的信号强度表现出非常好的稳定性，没有像ICG那样明显衰减（图1d），这对于持续监测血管血流动力学行为非常有利。
图1. 在去离子水中分散的AIE（聚集诱导发光）（BBT-C6T-DPA-OMe）纳米颗粒的表征
如图2a所示，在808nm激光（功率密度60毫瓦/平方厘米）下，AIE纳米颗粒的近红外二区信号（使用1300nm长通滤波器）比ICG强得多，并且随着浓度的增加在小鼠血清和去离子水中的信号显著增强。这表明了BBT-C6T-DPA-OMe纳米颗粒在生理环境中的良好荧光性能。相比之下，ICG的荧光强度随浓度增加逐渐下降，这归因于ACQ效应。此外，与ICG相比，在相同的激光激发和滤波器条件下（激光808nm，1300nmLP滤波器），AIE纳米颗粒显示出更高的亮度（图2b）。当使用980nm激发波长时，由于较长的吸收波长，BBT-C6T-DPA-OMe纳米颗粒仍然显示出强烈的荧光信号强度，而ICG由于其受限的激发波长，未检测到近红外二区信号（图2c、d）。这些结果表明，BBT-C6T-DPA-OMe纳米颗粒在体内成像或监测方面的潜力优于ICG。
图2. BBT-C6T-DPA-OMe纳米颗粒在小鼠血清中的NIR-IIa信号评估
如图3a所示，AIE纳米对比组成功实现了玻璃毛细管的高保真成像，而在ICG组中，随着深度增加，可见性显著降低。直接反映成像分辨率的玻璃毛细管信号的半峰宽度（fwhms）在AIE纳米对比剂组中在小于3毫米的范围内几乎不受组织厚度的影响（图3b）。相反，ICG组中毛细管的半峰宽度显著增加，这归因于近红外一区明显的散射效应。此外，与ICG相比，BBT-C6T-DPA-OMe NPs在Intralipid溶液的每个深度都显示出更高的信号噪音比（SBRs）（图3c）。为了进一步验证BBT-C6T-DPA-OMe纳米粒子作为良好荧光对比剂的潜力，我们在真实组织（鸡胸肉和脂肪组织）下评估了其成像深度（图3d）。在模拟血管造影之前，我们将鸡肉和脂肪组织预热至37℃（接近实验动物的体温），以减少温度对组织散射的影响。如图3e所示，组织厚度在3毫米以内几乎不影响半峰宽度，且覆盖着组织的玻璃毛细血管的直径与不覆盖组织的非常接近。相比之下，在使用商用染料ICG进行真实组织模拟的血管造影中，半峰宽度显著增加，导致信噪比（SBR）较低（图3f）。这些结果显示了发光的BBT-C6T-DPA-OMe纳米粒子所实现的理想穿透深度和对比成像信噪比。
图3. 基于BBT-C6T-DPA-OMe纳米粒子的血管造影模拟以及它们对组织穿透深度和信噪比（SBR）的评估
在图4a中显示的相应横截面强度剖面具有尖锐的峰值。我们识别了主要股动脉的两个峰值，然后用高斯函数进行拟合。从近红外-II血管造影图像中测得的血管直径分别为0.207毫米（股动脉）和0.175毫米（股静脉），可通过高斯拟合的半峰宽度来大致确定。此外，从股动脉起源的四条小动脉的高分辨率近红外-II血管造影中清晰可见（图4b）。相应的横截面强度剖面包含了四个尖锐的峰值，这表明了四条动脉分支（直径分别为0.123毫米、0.139毫米、0.055毫米和0.113毫米）的直径（图4b）。相比之下，使用ICG进行的股静脉NIR-I荧光血管造影（激光波长808纳米，滤波器1000 LP）显示出模糊的血管解剖结构和宽强度峰值（图4c和d）。
图4. 使用BBT-C6T-DPA-OMe纳米粒子和ICG分别在近红外-II和I区小鼠股动脉进行的荧光血管造影图像
在通过尾静脉注射BBT-C6T-DPA-OMe纳米粒子（6毫克/毫升，200微升）后的0.5秒，心脏（右心房，RA）首先在腹部视图中发出荧光（图5a和视频S1）。随后，大约0.75秒后，肺叶的近红外-II荧光信号开始出现，然后在大约2.66秒和6.06秒后分别出现了肠系膜和肝脏。随着循环时间的增加，腹部皮下血管网络逐渐变得更加清晰，其清晰度大约在28秒左右。在背部视图中，肺叶首先发出荧光，然后依次用荧光照亮肾脏、大脑、脊椎和浅层血管（图5b）。器官中的照明时间滞后也可以通过强度-时间曲线显示出来（图5c-f）。
图5. BBT-C6T-DPA-OMe NPs基于NIR-IIa动态成像的生命重要器官灌注评估
注射BBT-C6T-DPA-OMe NPs后的10.03至37.71秒内，可观察到从阻塞点到远端股动脉及其随后的较小分支的血流信号流动（图6a）。从每个时间点的多个图像帧中提取了血流信号的传播距离，并绘制了随时间变化的图表。这呈现出线性相关性，得到了血液速度为1.513 ± 0.081 mm/s（图6b）。随后，我们量化了这些图像中血流信号的主要荧光强度，并绘制了荧光强度与时间的曲线，保持了线性关系，斜率为5.72 ± 0.181% s⁻¹（图6c）。通过整合图7b和c，得到了血流距离和荧光强度（图6d）。
图6. 在缺血性后肢中计算股动脉的血流速度
总的来说，基于AIEgen的NIR-II发射性纳米对比剂已成功制备并表征。与常用的ICG染料相比，AIE纳米对比剂具有良好的光稳定性、高亮度和理想的成像对比度，使其能够在体内实时监测血液循环系统。研究结果表明，利用基于AIEgen的NIR-II纳米对比剂可以实现对PAD小鼠的高清晰度荧光血管造影、器官灌注和生命体征监测以及血液动力学评估。特别是，建立了荧光信号强度与血流速度之间的线性关系，可以通过血流荧光强度变化直接评估血液动力学。因此，具有高亮度和光稳定性的BBT-C6T-DPA-OMe NPs为血液循环系统监测提供了一个有前景的成像工具，并有助于循环系统疾病的诊断。
参考文献
Zhang, R.; Bi, Z.; Zhang, L.; Yang, H.; Wang, H.; Zhang, W.; Qiu, Z.; Zhang, C.; Xiong, Y.; Li, Y.; Zhao, Z.; Tang, B. Z., Blood Circulation Assessment by Steadily Fluorescent Near-Infrared-II Aggregation-Induced Emission Nano Contrast Agents. ACS Nano 2023, 17 (19), 19265-19274.
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