文献背景
蚜虫是具破坏性的农业和园艺害虫，以韧皮部为食，超过40%的植物病毒依靠蚜虫传播来感染植物，因此对作物生产造成了大规模的破坏。蚜虫侵害会诱导植物释放包含水杨酸甲酯（MeSA）、水杨酸结合蛋白-2（SABP2）、转录因子NAC2和水杨酸-羧甲基转移酶-1（SAMT1）在内的VOCs。MeSA在植物防御蚜虫等草食性昆虫侵害中发挥重要作用，包括驱除昆虫、吸引捕食者或降低昆虫的生存适应性等方式。MeSA被认为是植物内部和长距离移动信号，参与诱导对微生物病原体和食草昆虫的系统获得性抗性（SAR）。在SAR过程中，水杨酸（SA）在病原体感染的细胞中积累，并通过SAMT1转化为MeSA；然后，MeSA通过韧皮部进入远端组织，随后在未侵染叶中被SABP2重新转化为SA。虽然已知MeSA作为植物内SAR信号的功能，但MeSA如何作为植物间通讯的信号激活AD抗蚜虫防御是一个长期未解决的问题。植物是否拥有识别和感知空气中MeSA的受体也不清楚。此外，蚜虫和病毒能否干扰植物气传性免疫也未知。本研究揭示了AD的分子机制和蚜虫-病毒共同进化的共生关系，证明AD是控制蚜虫和病毒的潜在仿生策略。
基本信息
Molecular basis of methyl-salicylatemediated plant airborne defence
期刊：
Nature
影响因子：64.8
通讯作者：
刘玉乐
作者单位：
清华大学等
索莱宝合作产品：
产品货号 | 产品名称 |
IB0100 | 6-苄氨基喋呤（6-BA） |
IA1310 | 腺苷-5'-三磷酸 |
N8010 | α-萘乙酸（NAA） |
摘要
蚜虫是具破坏性的作物害虫之一，被蚜虫侵害的植物会释放挥发性化合物，以引起邻近植物的气传性免疫（AD）。本文揭示了MeSA、SABP2、转录因子NAC2和SAMT1形成了信号通路来介导邻近植物针对蚜虫和病毒的AD。空气中MeSA能够被MeSA受体蛋白水杨酸结合蛋白-2（SA-binding protein-2，SABP2）感知并转化为水杨酸（salicylic acid, SA）。水杨酸引起信号转导级联反应，SA激活转录因子NAC2，上调水杨酸羧基甲基转移酶1（SA-carboxylmethyltransferase-1，SAMT1）基因的表达，激活NAC2-SAMT1模块从而产生更多的MeSA，诱导植物的抗蚜虫免疫，从而降低病毒的传播。一些蚜虫传播病毒比如黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒等能够编码含有解旋酶结构域的蛋白质，通过与NAC2蛋白相互作用来抑制AD，改变NAC2蛋白的亚细胞定位，促进NAC2在细胞质中被26S蛋白酶体降解，从而负调控NAC2-SAMT1通路，抑制MeSA的合成和挥发，阻断植物间“预警”通讯，促进蚜虫对邻近植物的侵染和对病毒的传播。本研究揭示了AD的分子机制和蚜虫-病毒共同进化的共生关系，表明AD是一种潜在的生物仿生策略，可以控制蚜虫和病毒的传播。
研究内容及结果
作者通过免疫沉淀-质谱分析策略（IP-MS），成功鉴定了本氏猪笼草中黄瓜花叶病毒（CMV）的病毒发病机制过程中，核心蛋白CMV1a的相互作用蛋白组，并确定NAC2为CMV1a的重要相互作用因子，以进行后续实验（扩展数据图1a）。CMV1a-NAC2相互作用通过免疫共沉淀（co-IP）、双分子荧光（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）试验进一步验证（扩展数据图1b-d）。为了评估NAC2是否影响CMV对NAC2.1/NAC2.2双敲除（KO）突变株的感染，通过比较CRISPR-cas9基因编辑（扩展数据图2a）产生的突变株（NAC2植株）和野生型（WT株）的感染结果，发现CMV感染导致NAC2突变株的症状更严重，病毒RNA和外壳蛋白（CP）的量更高（扩展数据图1e-g）。用GFP标记的马铃薯病毒Y或GFP标记的TMV（TMV-GFP）感染的突变株和野生型植株中也有类似的结果（扩展数据图1h-m）。这些数据表明，NAC2对植物抗病毒防御至关重要。 
扩展数据图1
2. 证明NAC2通过MeSA介导AD对抗蚜虫
作者在研究中注意到，在NAC2叶子上定植的绿桃蚜虫数量比在WT叶子上的数量多得多，进一步研究了NAC2植株对蚜虫吸引力的作用。作者进行了圆形培养皿和Y管嗅觉仪生物测定，发现NAC2植株比WT植株吸引了更多的蚜虫，推测这可能是由空气传播信号介导的（扩展数据图1n-o）。作者使用气相色谱法与MS（GC-MS）相结合来鉴定蚜虫侵袭的WT植株与NAC2植株释放的挥发物。而MeSA是蚜虫侵袭WT植株与NAC2植株产生差异的VOC，并且蚜虫侵染后WT释放的MeSA多于NAC2植株（扩展数据图2e-h）。MeSA是有据可查的可诱发蚜虫的VOC10-13主要挥发物。为了测试NAC2植株对蚜虫吸引力的影响是否归因于MeSA的挥发，研究人员使用GC-MS测量了对蚜虫侵袭的WT植株在空气中MeSA的排放率，发现每个蚜虫侵袭的WT植株MeSA的排放率为34ng h−1（相当于每天排放0.816µg）（扩展数据图2f）。此外，研究人员发现，含有0.8µg MeSA/羊毛脂处理的植株与蚜虫侵袭的WT植株有相似的MeSA排放（扩展数据图2i，j）。因此，研究人员使用0.8µg MeSA/羊毛脂涂抹对植株进行处理，结果表明NAC2和WT植株对蚜虫表现出相似的吸引力（扩展数据图1p，q）。然而，当单独用羊毛脂或羊毛脂与其他挥发物（如3,3-二甲基己烷）处理时，NAC2植株比WT植株对蚜虫更具吸引力（扩展数据图1r，s）。研究人员将NAC2和WT植株置于挥发性MeSA下24 h，然后通风2h，并比较了气态MeSA如何影响植株对蚜虫的吸引力。在这样的条件下，WT植株对蚜虫的驱避性更强（扩展数据图1t，u）。然而，在通风和不进行挥发性MeSA处理后，NAC2植株之间的蚜虫驱避性没有明显差异（扩展数据图1v，w）。此外，与未进行MeSA处理时观察到的情况一样，在MeSA处理下，与挥发性MeSA处理随后通风的WT植株相比，NAC2植株对蚜虫的吸引力仍然更大（扩展数据图 1x，y）。
为了解释这种现象背后的原因（扩展数据图1t-y），研究人员用挥发性MeSA处理NAC2或WT植株24 h，然后通风，量化接收植株（接收器）排放的挥发性MeSA。WT植株反而在空气中释放出更高水平的MeSA（图1a，b）。随后研究人员比较了蚜虫MeSA接收植株与模拟WT植株在涂抹后的吸引力，所有植株都含有MeSA/羊毛脂，但发现它们在蚜虫偏好方面没有差异（图1c，d）。此外，在用MeSA/羊毛脂涂抹NAC2和WT接收植株后，这些MeSA接收植株还同样吸引蚜虫（图1e，f）。接下来，研究人员以蚜虫侵袭的植物为发射植株（发生源），研究了NAC2植株在自然露天环境下AD的作用（图3a）。在被吸汁蚜虫感染后，WT植株不断排放VOC MeSA（图1g，h）。值得注意的是，NAC2接收植株释放的MeSA波动性较低，但是当发生源受到蚜虫攻击时，与WT接收植株相比，其表现出对蚜虫更高的吸引力（图1i-l）。与邻近的模拟发射植株相比，受蚜虫侵染的WT相邻接收植株对蚜虫的驱避性更强，而与模拟蚜虫攻击发射植株相邻的NAC2接收植株之间的蚜虫驱避性没有显著差异（图1m，n）。此外，在以接收植株喂食24小时后，WT中的蚜虫存活率降低，但NAC2接收植株的存活率没有降低（图 1o，p）。这些结果表明，一旦感知到MeSA，邻近接收植株中的MeSA生物合成是以NAC2依赖性方式调节进而介导可对抗蚜虫的AD。
扩展数据图2
图1
3. NAC2激活SAMT1转录
接下来，研究人员开始探索NAC2和MeSA生物合成之间的分子遗传机制。NAC2作为转录因子（扩展数据图3b），可以定位于细胞核中（扩展数据图3c）。随后，研究人员对有和没有蚜虫喂食的WT和NAC2植株进行了RNA测序（RNA-seq）和比较转录组分析，并鉴定了许多潜在的NAC2调节差异表达基因（扩展数据图4和补充表1和2），其中SAMT1的结果特别令人感兴趣（扩展数据图4e）。无论这些植物是否受到蚜虫的侵袭，NAC2植株的SAMT1 RNA水平都低于WT植株（补充表1和2）。SAMT1将SA转化为MeSA19，研究人员通过定量研究NAC2、HA-NAC2过表达和WT植株叶片组织中的SAMT1转录本，以评估NAC2是否通过调节SAMT1的转录表达。结果表明，与WT植株相比，NAC2植株的SAMT1 mRNA水平显著降低，但HA-NAC2过表达植株的SAMT1 mRNA水平升高（扩展数据图3d，e）。此外，荧光素酶报告基因实验表明，NAC2增强了SAMT1启动子控制下的报告基因的转录（扩展数据图3f）。ChIP–qPCR、酵母单杂交和EMSA分析均表明，NAC2与SAMT1启动子结合，并激活报告基因转录（扩展数据图3g-i）。此外，NAC2的瞬时过表达增加了植物MeSA的产生（扩展数据图 3j）。这些结果表明，NAC2-SAMT1模块与植物MeSA生物合成的调控有关。
扩展数据图3
扩展数据图4
4. SA激活NAC2-SAMT1模块引发AD
为了研究NAC2是否通过激活SAMT1转录影响接收植株MeSA的产生，研究人员评估了不同处理条件下突变株NAC2、NahG和WT植株中的NAC2和SAMT1的mRNA水平（图 2f）。蚜虫侵袭后，WT和NAC2植株的SA水平升高程度相近，然而，细胞MeSA和SAMT表达的增加仅在WT植株中发现（图2e-g）。在WT接收植株和NAC2接收植株邻近蚜虫侵袭植株中也发现了类似的结果（图 2h-j）。这些结果表明，NAC2是蚜虫定向诱导或蚜虫介导的SAMT1表达和挥发性MeSA产生所必需的。此外，外源性SA上调了NAC2和SAMT1在WT植株中的表达，但在NAC2突变株中SAMT1 mRNA的表达水平未显著改变（图 2k，l）。与NAC2突变株相比，外源性SA也诱导WT植株的MeSA挥发性和蚜虫驱避性（图2m–p），并增加SAMT1-KO植株中NAC2和SAMT1转录本的水平（图 2q；图2b，c），samt1植株对蚜虫的吸引力也更强，而且在samt1植株中外源性SA不诱导蚜虫驱避（图2r-t）。此外，暴露于蚜虫侵袭的samt1植株中挥发性MeSA的产生减少（图3a，b），在进一步的蚜虫行为学实验中，研究人员发现与邻近模拟的WT接收植株相比，邻近蚜虫侵袭的WT发射植株的WT接收植株对蚜虫的驱避性更强，然而，无论何时将这些发射植株暴露于蚜虫侵袭中，与NAC2或SAMT1发射植株相邻的WT接收植株在蚜虫驱避性方面都没有显著差异（图3c-e）。这些结果进一步证实了MeSA作为植物AD中PPC信号的作用。总的来说，结果表明SA可以激活NAC2-SAMT1转录进而增加发射和接收植株中挥发性MeSA的产生。
作为一种SA结合蛋白，SABP2也可以与MeSA结合，这对于细胞内MeSA转化为SA至关重要。因此，SABP2可以作为一种OBP样受体，感知并将发射植株产生的挥发状态MeSA转化为SA以触发NAC2介导的接收植株中的蚜虫抗性。为了验证这一想法，研究人员首先确认SABP2与SA结合（图3f），通过竞争结合实验验证MeSA是否影响SABP2-SA的结合活性（图3g）。在无MeSA的情况下，SABP2-[3H]SA（50 Ci mmol−1）结合力为100%。然而，在相同的实验条件下，3nM和15nM的MeSA，SABP2对[3H]SA的结合活性分别降低到约74%和46%（图3g）。因此，3nM的MeSA足以满足用于[3H]SA与SABP2的竞争结合实验，表明MeSA可以以生理浓度与SABP2结合。随后，研究人员建立了SABP2-KO突变株（sabp2），并测试了sabp2突变株与WT植株的蚜虫驱避性，用挥发性的MeSA处理，然后进行通气，挥发性的MeSA处理可增加WT的蚜虫驱避性和SA生物合成，但对于sabp2突变株并没有增加（图3h-j和扩展图2d）。此外，蚜虫喂食WT发射植株增加了WT植株的蚜虫驱避性，但sabp2未增加（图3k）。此外，外源性的SA对WT和sabp2植株的MeSA挥发性无显著差异，表明SABP2对MeSA的释放不是必须的（图3l，m）。这些结果表明，SABP2确实是一种OBP样受体，可以感知并将空气中的MeSA转化为SA，引起NAC2介导的蚜虫驱避性。
SAMT1是植物抗病毒免疫所必需的。为了测试SAMT1是否为NAC2介导的植物抗病毒免疫中的一个组成部分。研究人员敲低（KD）samt1植株中的NAC2，使用基于烟草脆裂病毒（TRV）诱导的基因沉默产生nac2/samt1双突变植株。与NAC2突变株一样，NAC2-KD植株表现出正常生长，和对CMV和PVY的高易感性（图1e-j，扩展数据图5a-e，h-l），表明病毒诱导的基因沉默NAC2-KD与NAC2-KO株有相似性。然而，nac2/samt1和samt1植株表现出相似程度的CMV或PVY易感性（图 5a-e，h-l）。此外，CMV感染增强了植物细胞内MeSA水平（扩展数据图5f）。在病毒感染期间，NAC2-KD、samt1和nac2/samt1植株的未侵袭叶片产生相似数量的MeSA，但与WT植株相比，数量较低（扩展数据图5g）。此外，作者还研究了外源性MeSA或SA在nac2、sabp2、samt1和WT不同植株中，MeSA是否以及如何通过NAC2介导植物抗病毒防御。与WT植株相比，nac2、samt1和sabp2植株对CMV和PVY更易感（图3n，o）。然而，外源性MeSA可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性，但对sabp2植株无效（图 3n，o），可能是由于WT、nac2和samt1植株中的MeSA转化为 SA。外喷SA也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性（图3n，o）。这与以下事实一致：SA可以抑制多种病毒对植物的感染，包括CMV、马铃薯病毒X和TMV。
综上所述，MeSA结合蛋白SABP2能够在结合MeSA时，将细胞间的MeSA转化成SA。由此实现信号的发起。随后SA激活NAC2-SAMT1模块，以此上调内源MeSA水平，促进NAC2依赖性SAMT1的转录与翻译。
扩展数据图5
5. CMV1a破坏NAC2的稳定性以抑制AD
研究表明CMV感染可以抑制蚜虫诱导的AD（图4a），从而有利于蚜虫的生存和病毒的传播与感染，可能是通过CMV介导MeSA所致。CMV1a-NAC2相互作用（扩展数据图1a-d）表明CMV1a可能参与CMV介导的AD抑制。为了验证这一点，首先生成了表达CMV1a的转基因烟草植物（扩展数据图6a，b），并评估了CMV1a对植物、蚜虫和AD吸引力的影响。圆形培养皿和Y管嗅觉仪生物测定表明，CMV1a表达导致植物对蚜虫具有更高的吸引力（扩展数据图 6c，d）。表明CMV1a参与CMV介导的AD抑制。
为了了解 CMV1a-NAC2相互作用在CMV介导的AD抑制中的重要性，研究人员鉴定了CMV1a中与NAC2相互作用的关键氨基酸。CMV1a由N端甲基转移酶和C端ATP依赖性解旋酶结构域（HD）组成。此外，研究人员发现CMV1a HD是CMV1a-NAC2相互作用的主要区域（扩展数据图6l）。随后，研究人员使用Alpha Fold-Multimer27模拟了CMV1a-NAC2复合物的结构，并观察到 CMV1a中983位的甘氨酸残基与NAC2物理距离最近，预测该残基可能是CMV1a与NAC2相互作用所必需的（扩展数据图6m，n）。CMV1a HD或全长CMV1a中的G983D突变严重降低了CMV1a-NAC2的相互作用（扩展数据图 6o-q）。
接下来，研究人员使用BiFC研究了CMV1a-NAC2相互作用的亚细胞定位，发现CMV1a在细胞核和细胞质中都与NAC2相互作用（图1c），这与没有CMV1a共表达的NAC2定位不同（图3c），表明CMV1a可以将一些NAC2从细胞核转移到细胞质。类似的还有CMV1a–MYC，但是cLUC–MYC和CMV1a（G983D）-MYC均未出现这种现象，这或许可以解释引起部分RFP-NAC2的细胞质定位和细胞核中较少的RFP荧光（扩展数据图 7a）。值得注意的是，CMV1a-MYC没有改变RFP核定位，表明CMV1a-MYC定向NAC2的重新定位取决于NAC2-CMV1a相互作用（扩展数据图7b）。此外，研究人员使用核输出信号（NES）标记的NAC2研究了细胞质NAC2的稳定性。结果发现NES-NAC2定位于细胞质中，NAC2易被26S-蛋白酶体系统降解（扩展数据图7c，d）。此外，瞬时CMV1a表达增强了26S-蛋白酶体系统对NAC2的降解，但不影响RFP稳定性（扩展数据图 7e-i），而CMV1a（G983D）未引起NAC2降解（扩展数据图7f–i）。
瞬时表达试验表明，是CMV1a而非CMV1a（G983D）抑制NAC2介导的SAMT1激活启动子（扩展数据图7j）。此外，CMV1a（G983D）或CMV1a植株与WT植株的Y管嗅觉仪生物测定和GC-MS分析表明，CMV1a（G983D）降低CMV1a介导的植物对蚜虫的吸引力和抑制MeSA挥发（扩展数据图7k-m）。而且Y管嗅觉仪生物测定提供了额外的证据，证实氨基酸残基Gly983对CMV1a抑制植株间AD至关重要。
综上所述，表明CMV1a通过与NAC2的直接相互作用，影响NAC2的亚细胞定位并破坏其稳定性，从而降低转录因子NAC2驱动的SAMT1激活和MeSA的产生，进而干扰和抑制AD。
图4
6. 一些蚜虫传播的病毒抑制AD
CMV1a具有甲基转移酶和解旋酶活性，并构成病毒复制酶复合物的一部分，通过其HD与NAC2相互作用（扩展数据图1a-d）。值得注意的是，来自许多蚜虫传播病毒的HDs，包括马铃薯Y病毒、黄蜂病毒、黄体病毒和阿尔法莫病毒在与CMV1a Gly983相对应的位置均含有保守的甘氨酸残基（扩展数据图8和9a）。
GC-MS分析显示，PVY感染并影响了蚜虫侵染后植物MeSA的挥发。此外，作者还研究了，两种蚜虫传播的病毒CMV和PVY使NAC2能够从细胞核到细胞质重新定位（扩展数据图9i）。同样，PVY CI，而不是CI（G347D）或非蚜虫传播病毒TMV的126KD蛋白，与NAC2相互作用（扩展数据图9j，k），并部分破坏NAC2的稳定性（扩展数据图9l）。这些结果表明，一些蚜虫传播的病毒已经进化到利用含HD的蛋白质作为干扰植物AD的一般策略。
扩展数据图8 
扩展数据图9
结论
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套装货号 | 套装名称 | 描述 |
IA1310 | 腺苷-5'-三磷酸 | 是体内能量储存和代谢的重要物质，为代谢提供能量，同时在细胞中作为辅酶发挥作用。 |
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IA2970 | 腺苷-5'- 单磷酸一水 | 是腺苷A1受体(adenosine A1 receptor)激动剂。 |
IB0100 | 6-苄氨基喋呤 (6-BA) | 是一种细胞分裂素，通过刺激细胞分裂引起植物生长和发育，可调节植物的抗氧化系统的活性。 |
IE0110 | 24- 表油菜素内酯 | 是一种植物生长激素。据报道，具有缓解植物重金属和农药胁迫潜力。此外，在各种癌细胞中是一种潜在的凋亡诱导剂，而不影响非肿瘤细胞生长。 |
IH0650 | 28- 高油菜素内酯 | 是一种具有生物活性的化合物。 |
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IN0540 | 1-萘乙酸(NAA) | 是具有生长素活性的合成植物生长调节剂。 |
II0430 | 3-吲哚乙酸 | 是一种植物生长激素。可以添加到细胞培养基中用来诱导植物细胞伸长和分裂。 |
II0500 | 吲哚丁酸 | 是植物生长素和良好的生根剂。它可以促进草本植物和木本观赏植物生根，并用于提高果实率。 |
II0540 | 吲哚丙酸 | 是一种有效的神经保护性抗氧化剂和植物生长素。 |
II0580 | 吲哚乙腈 | 是一种植物生长激素。 |
