引言
合成着色剂是人工合成的使食品着色和改善食品色泽的物质[1]，具有色泽鲜艳、性质稳定、成本低廉以及着色力强等特点，广泛应用于各类食品中，如糖果、糕点、蜜饯、饮料、罐头等。合成着色剂在现代食品工业中扮演着不可或缺的角色，赋予食品丰富的颜色，为消费者呈现出多样的选择。然而，随着人们对食品质量安全的日益关切，因合成着色剂生产环节的滥用以及消费环节的过量摄入而导致的一些列潜在危害，也引发了社会各界的广泛关注和讨论。
近期，食品安全国家标准审评委员会审查通过并发布了 85 项食品安全国家标准，其中包含了合成着色剂的检测标准— GB 5009.35-2023。
GB 5009.35-2023 新国标变化[2][3]：
1. GB 5009.35-2023 于 2023-09-06 正式发布，2024-03-06 正式实施；
2. GB 5009.35-2023 代替 GB 5009.35-2016、GB 5009.141-2016、GB/T 9695.6-2008、GB/T 21916-2008；
3. 相较于 GB5009.35-2016，GB 5009.35-2023 增加了靛蓝、诱惑红、酸性红和喹啉黄 4 种合成着色剂，增加和明确了适用基质种类，修改了样品前处理方法和仪器条件，修改了检出限和定量限。
赛默飞新国标应对方案亮点：
1. 赛默飞实验室完全参照标准梯度洗脱程序进行方法复现，为进一步优化灵敏度和分离度，仅将柱温提升至 35℃；
2. 柠檬黄和新红、喹啉黄-5 与苋菜红、喹啉黄-6 与胭脂红、日落黄与喹啉黄-2、酸性红与喹啉黄-3 均可基线分离，实现准确定性和定量；
3. 酸性红出峰位置在亮蓝-1 之后，不会干扰亮蓝-3 的定性定量，分离和保留效果优于标准提供的参考谱图；
4. 基于 Chromeleon 7.3 数据处理软件，采用化合物组模式对喹啉黄和亮蓝的多个异构体进行准确定量，提升工作效率。
GB 5009.35-2023 赛默飞应用解决方案
01仪器配置及色谱条件
液相色谱仪：Vanquish™ Core HPLC 液相色谱系统，配合变色龙数据处理软件
色谱柱：
Acclaim 120 C18, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 059149)
Betasil C18, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 70105-254630)
四元泵 Pump: VC-P20-A
流动相：A: 20 mM 乙酸铵 B: 甲醇
流速：1.0 mL/min
梯度洗脱程序：
自动进样器 Sampler Module: VC-A12-A
进样量：10 μL；样品盘温度：15 ℃
柱温箱 Column Comp: VC-C10-A
柱温：35 ℃
检测器 DAD: VC-D11-A (UV/Vis)
采集波长：415 nm, 520 nm, 610 nm；
采集频率：5 Hz；
光谱采集：400-800 nm
02谱图及数据
2.1
Acclaim 120 C18 应用于 11 种合成着色剂的分离
图 1 415/520/610 nm 下，11 种合成着色剂分离叠加谱图 (20.0 μg/mL, 10 μL)
图 2 415 nm 下，柠檬黄和喹啉黄分离谱图及数据 (20.0 μg/mL, 10 μL)
图 3 520 nm 下，新红等 7 种合成着色剂分离谱图及数据 (20.0 μg/mL, 10 μL)
图 4 610 nm 下，靛蓝和亮蓝分离谱图及数据 (20.0 μg/mL, 10 μL)
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2.2
喹啉黄与亮蓝异构体的分离
2.2.1 喹啉黄异构体的分离
食品添加剂喹啉黄是由 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 （Ⅰ型）或 三分之二 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮和三分之一 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮的混合物（Ⅱ型）磺化而制得的。其中，Ⅰ型工艺产品主成分为 2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮二磺酸二钠盐 (≥80.0%)，2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮单磺酸钠盐 (≤15.0%)，2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮三磺酸三钠盐 (≤7.0%)，副染料 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 和 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮 (≤4.0%)；Ⅱ型工艺产品主成分为 2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮二磺酸二钠盐 (≥70.0%)，副染料 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 和 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮 (≤4.0%)[4]。由于在磺化反应过程中取代位点的不同，使得 2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮二磺酸二钠盐 QYNa2 有两种异构体 QYNa2Ⅰ和 QYNa2Ⅱ，2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮单磺酸钠盐 QYNa 也有两种异构体 QYNaⅠ和 QYNaⅡ[5]。
因此，食品添加剂喹啉黄由于合成及纯化工艺的差异，在色谱分离时会出现多个色谱峰，相同的发色基团在 415 nm 下，最多可能有 7 个色谱峰；而标准品喹啉黄通常是经色谱制备纯化除去副染料，最多可能分出 5 个色谱峰。如图 5 所示，喹啉黄的 7 个组分光谱图高度相似，喹啉黄-1/2/3/4 与新国标标记的 4 个喹啉黄组分出峰顺序及保留时间相一致，喹啉黄-5/6/7 可能是 QYNa3 或副染料成分，时常会因色谱分离不充分而被混标中其他相邻峰包埋，进而被忽视。
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图 5 415 nm 下，喹啉黄异构体分离谱图 (100.0 μg/mL, 5 μL)（点击查看大图）
2.2.2 亮蓝异构体的分离
食品添加剂亮蓝的合成工艺路线是由一份苯甲醛邻磺酸与两份 N-乙基-N-(3-磺基苄基)-苯胺为原料经缩合、氧化而制得[6]。其中，N-乙基-N-(3-磺基苄基)-苯胺系 N-乙基-N-苄基苯胺磺化而得，磺化位置主要在其苄基上的间位，其次对位，邻位磺化则较难。由于难以分离故 N-乙基-N-(3-磺基苄基)-苯胺的工业品实际是三个异构体的混合物，一般大致组成为间位物 (m) : 对位物 (p) : 邻位物 (o)=75~85 : 15~20 : 0~8。因此，制得的亮蓝商品色素其主成分亦应是 m-m、m-p、m-o、p-p、p-o、o-o 6 个同分异构体的混合物[7]。而 o-o 和 o-p 同分异构体的占比非常低，市售工艺纯亮蓝的液相色谱图通常会呈现出 4 个色谱峰。如图 6 所示，亮蓝的 4 个组分光谱图高度相似，亮蓝-1/2 与新国标标记的 2 个亮蓝组分出峰顺序及保留时间相一致，亮蓝-3/4 在标准中被忽略掉了，其中亮蓝-3 可能会受到酸性红的干扰。
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图 6 610 nm 下，亮蓝异构体分离谱图 (100.0 μg/mL, 5 μL)（点击查看大图）
2.3
11 种合成着色剂标准系列工作液校准曲线
图 7 柠檬黄和喹啉黄 线性叠加谱图 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)
图 8 新红等 7 种合成着色剂 线性叠加谱图 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)
图 9 靛蓝和亮蓝 线性叠加谱图 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)
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2.4
样品及样品加标谱图
图 10 维生素功能饮料样品及样品加标谱图 （柠檬黄、胭脂红有检出）
图 11 茉莉花茶样品及样品加标谱图
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2.5
喹啉黄和亮蓝异构体的定量
图 12 喹啉黄和亮蓝异构体采用化合物组进行定量示意图
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Tips: 关于化合物组定量，想要了解更多变色龙软件的操作细节？欢迎咨询赛默飞液相色谱应用团队
2.6
Betasil C18 应用于 11 种合成着色剂的分离
（补充方案）
图 13 Betasil C18 应用于 11 种合成着色剂分离谱图 (20.0 μg/mL, 10 μL)（点击查看大图）
03GB 5009.35-2023 相关色谱耗材推荐
参考文献：
[1] GB 5009.35-2023 食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定
[2] GB 5009.35-2016 食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定
[3] GB 2760-2014 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准
[4] GB 1886.104-2015 食品安全国家标准 食品添加剂 喹啉黄
[5] DBS32/ 012-2016 食品安全地方标准 食品中喹啉黄的检测 高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法
[6] GB 1886.217-2016 食品安全国家标准 食品添加剂 亮蓝
[7] 丁秋龙,王丽斌,陈建新. 食用亮蓝色素之同分异构体研究
