尽管细胞外囊泡(EVs)在细胞间通讯中发挥作用，但它们的不同种群及其分泌机制尚未表征：EVs如何以及在何种程度上形成为内吞隔室腔内囊泡(外泌体)或在质膜(PM)上形成囊泡(ectosomes)仍不清楚。该研究跟踪了EV标志物CD9和CD63从内质网到它们的驻留区室，分别是PM和晚期内体的细胞内运输。在它们最终分离之前，观察到两个地方的瞬时共定位。CD9和稳定在PM的突变CD63在EV中比CD63更丰富地释放。因此，在HeLa细胞中，ectosomes比外泌体分泌更多。通过比较蛋白质组学分析和对内体pH中和的差异反应，确定了一些可能对外泌体(LAMP1)或ectosomes(BSG、SLC3A2)具有特异性的表面蛋白。该研究工作为任何细胞类型中外泌体和小ectosomes的分子和功能区分开辟了道路。
所有细胞都会在其环境中释放膜包裹的囊泡，统称为细胞外囊泡(EV)。这些EV包含来自其起源细胞的一组选定的脂质、核酸和蛋白质，因此可以将一系列复杂的信息传输到周围或远处的细胞。EV可以通过从原核和真核细胞的质膜(PM)直接向外出芽形成。在真核细胞中，EV也可以首先作为内吞途径(MVB)的内部多泡隔室的腔内囊泡形成，然后在这些隔室与PM融合时分泌。为了阐明命名法，最近建议专门针对MVB衍生的EV使用术语“外泌体”，而不是针对所有小型EV；另一方面，PM衍生的EV被称为各种名称，例如微泡、微粒或胞外体。
由于它们在不同的亚细胞位点形成，外泌体和胞外体可能包含不同组的特定货物，因此具有不同的功能。然而，由于难以将生物流体或细胞条件培养基中存在的相同大小的外泌体与外泌体分离，缺乏区分外泌体与胞外体的特异性蛋白质标记，以及分子机制和具有对一个或另一个特异性的工具。
使用HeLa细胞去研究分析EV的分布，免疫荧光结果表明CD63主要位于细胞内区室中。相反，CD9主要存在于质膜上，但也存在于罕见的暗淡细胞内区室中。在稳态下没有观察到两种蛋白质的明显共定位。
pHluorin在酸性条件下实际上是无荧光的，但在中性pH时发出荧光，因此使其成为观察酸性晚期胞内MVB与质膜融合的理想报告分子。由于细胞外部环境处于中性pH，因此在融合过程中会发生酸到中性的转换。免疫电镜表明在所有时间点，大多数MVB和溶酶体仅包含CD63而不是CD9。
溶酶体靶向基序进行突变为CD63-YA，CD63-WT-eGFP或CD63-YA-eGFP RUSH质粒转染的HeLa细胞；结果显示，在稳定状态下，与CD63-WT相反，CD63-YA主要位于细胞外围和一些小的细胞内区室中。动力监测结果显示，突变体CD63-YA 不会进入酸性内部隔间；同时，用生物素处理后，结果显示CD9和CD63-YA在添加生物素后约1h达到相似的表面(AF647)/总(GFP)荧光强度比为1，在稳态下进一步增加至约2；相比之下，对于CD63，最大表面/总比值增加但保持低于1，直到添加生物素后2h，并在2h和稳态之间下降，CD63-YA和CD9表现相似并在质膜上积累。
4、PM蛋白在CD9-EV中富集，而内体/溶酶体和PM跨膜蛋白都在CD63-EV中富集
为了更好地确定CD63+和CD9+EV的起源，并鉴定PM或内体释放的EV的特定标志物，研究者进行了定量质谱分析；同步分泌的CD63或CD9 EV的定量质谱分析揭示了质膜和内体衍生的EV的特征，PM蛋白在CD9-EV中富集，而内体/溶酶体和PM 跨膜蛋白都在CD63-EV中富集。
这项工作旨在确定含有不同四跨膜蛋白的EV的实际外泌体或外泌体性质。为了确定这些细胞释放的EV的亚细胞起源，研究者通过时间控制的方式跟踪四跨膜蛋白的细胞内运输，从它们在内质网(ER)中的初始合成到它们在EV中的分泌。研究结果表明，CD63和CD9都可以在质膜形成的小ectosomes中释放，并且在HeLa细胞中，外泌体代表小EVs(sEVs)的一个小亚群，它们携带CD63和其他晚期内体分子，如LAMP1/2。它们的分泌特别容易受到内体pH值的中和。BSG和SLC3A2被鉴定为HeLa细胞中ectosomes分泌的特定标记物，相反对内体pH中和不敏感。有趣的是，CD81是另一种常用作外泌体和/或小EV标记物的四跨膜蛋白，其行为类似于CD9而不是CD63。此处确定的外泌体与ectosomes的特异性标志物和分子机制将为进一步研究以破译它们各自的功能铺平道路。
参考文献：
标题：Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9
期刊：Nat Commun
发表时间：2021年
影响因子：17.694
货号 | 产品名称 | 规格 |
abs9775 | 外泌体提取试剂盒 | 1mL |
abs9777 | 外泌体纯化试剂盒(SEC) | 1mL |
abs50039 | 血浆血清外泌体提取试剂盒 | 20T |
abs50040 | 细胞上清外泌体提取试剂盒 | 20T |
abs132700 | Rabbit anti-CD63 Polyclonal Antibody | 50ug |
abs102483 | Rabbit anti-CD9 Polyclonal Antibody(Center) | 50uL |
abs06006 | Recombinant Human CD81 Protein(C-10His) | 50ug |
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