新开发的疗法，如干细胞疗法，正在将医学领域从治疗症状转变为治愈疾病。人类诱导多能干细胞(iPSCs)以其分化为不同细胞类型和组织的能力改变了再生医学。虽然人类iPSCs已经用于自体治疗，但下一个突破将是开发经认证的iPSCs用于现成的治疗。为了实现这一目标，可以通过人类白细胞抗原(HLA)消耗来降低异种iPSCs的免疫原性，从而建立GMP级的主细胞库，用于细胞的大规模生产，同时降低同种异体疗法的制造成本[1]。
开发基因工程的iPSCs需要在转染后进行几轮克隆筛选，传统的有限稀释法分离单细胞耗时长，荧光标记分选影响高度敏感的iPSCs的存活率，并且有污染的风险。相比之下，CYTENA的克隆筛选单细胞打印系统利用透明微流控芯片和实时成像技术、算法，以高活力和高效率将单细胞分选和分配到96/384孔板内。
近年来，利用此设备分离iPSCs的方法已被报道[2-4]。在这里，展示了使用UP.SIGHT在不损失多能性的情况下，对人类iPSCs温和分离单细胞克隆在技术上是可行的，在方法优化后的单克隆回收率高达80%。
材料与方法
来源于人成纤维细胞的对照iPSCs在无滋养层细胞的6孔板中，用TeSR E8培养基培养[5]。细胞汇合度到70%的时候，按1:3 ~ 1:6比例稀释传代。用于单细胞分选的细胞也在60- 70%的汇合度下进行收获，确保细胞看起来健康且未分化的状态,并以0.5-0.8x10 6个细胞/ mL的浓度在基础培养基中重悬为单细胞悬液。将80 uL的单细胞悬液装入芯片（EASY.ON cartridge）并安装在UP.SIGHT上进行单细胞分选。单细胞重悬液和孔板中的克隆培养基中都含有ROCK抑制剂，单细胞分选于装有克隆培养基的96孔板上，分选完的板子尽快转回培养箱中培养。在前7天用UP.SIGHT监测iPSCs的单克隆生长。
结果与讨论
对照组采用手动有限制稀释法，浓度为0.5个细胞/孔进行铺板 [6-7]，10天后达到了预期的10-20%的克隆率(数据未显示)。使用UP.SIGHT进行的第一次分选实验在相同的条件下获得了6%的克隆率(图1 A)。以这些实验设计为基准，通过系统的逐步优化条件来逐渐提高回收率。
首先，我们优化了装载在UP.SIGHT墨盒上的细胞重悬液。确定与使用原始基础培养基相比，使用盐水缓冲液后近乎使克隆恢复提高一倍(图1 B)。其次，由于iPSCs通常需要定期更换培养基，这种在早期更换培养基的操作对脆弱敏感的iPSCs的生长是有不利的，我们测试了在分选后的前7天中通过添加补充制剂到培养基中来避免更换培养基组份的效果。用补充制剂A(图1 C)和不同浓度的补充制剂B(图1 D和E)添加到克隆培养基，均可以获得更高的单克隆率，其中补充制剂B可提高到50%。
图1：优化分选提高克隆回收率
A:初始重悬细胞液条件，与标准培养条件最相似。B:盐溶液作为重悬液。C:添加了补充制剂A的克隆培养基. D-E:添了不同浓度补充制剂B的克隆培养基. F:克隆培养基改为添加了补充制剂B的单细胞克隆培养基。克隆恢复值以第7-10天克隆生长孔的百分比表示。
添加剂能够保持分选后的培养板细胞在前7天不受干扰，显著提高了克隆率。在7天后，我们获得了更大尺寸和良好形态的克隆团(图2)。最后，我们替换了克隆板中的标准培养基，并使用优化的培养基进行iPSCs的单细胞接种，优化条件包括盐溶液重悬样品，加上适合目的的克隆培养基，并以优化浓度的培养基补充物等，从而获得高达80%的单克隆率(图1 F)和长势良好的克隆团(图2)。
（值得一提的是：此次实验还测试了其他没有显著影响克隆恢复的参数。如，不同的ROCK抑制剂配方、板涂层和板类型。但不能认为这些变量在其他实验条件下使用时不会对克隆恢复产生影响。）
图2：克隆生长与形态
使用UP.SIGHT分选单细胞到96孔板中，并在第7天进行板底成像。
本实验中对UP.SIGHT板成像能力也进行了测试。从图中能够确认图像质量足够好，可以评估克隆的形态，以确定细胞在单细胞分选后是否保持其典型的iPSCs形态(图2)。
图3：用UP.SIGHT进行克隆生长监测
此外，UP.SIGHT上的成像系统与传统显微镜相比具有更快的优势:整个孔板(96/384孔板)的图像采集不到6分钟，大大减少了孔板在培养箱外的停留时间，尤其是384孔板。当在全孔板上进行初始筛选时，这一点特别重要，可以在多个时间点快速进行成像(图3)。
结论
本研究表明，使用UP.SIGHT分选iPSCs可获得良好形态的克隆团，具有较高的克隆恢复率。为了克隆恢复，可通过优化关键参数：细胞在分选前收获时的活率和生长状态、细胞悬液、克隆培养基及补充物，以确保细胞在分选后的第一天尽可能不受干扰；UP.SIGHT的快速平板成像功能可实现生长克隆的形态监控和快速筛选。
总之，UP.SIGHT是一种多用途仪器，可实现高效、高质量和节省时间的iPSCs分选和早期监测，以选择正确优质的单克隆。
参考文献[1] Jarrige, M., Frank, E., Herardot, E., et al. (2021). The future of regenerative medicine: Cell therapy using pluripotent stem cells and acellular therapies based on extracellular vesicles. Cells 10, 1–29. 10.3390/cells10020240.[2] Chen, Y., Tristan, C.A., Chen, L., et al. (2021). A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods 18, 528–541.[3] Vallone, V.F., Telugu, N.S., Fischer, I., et al. (2020). Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub- Cloning of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol 55.[4] Krol, R.P., Yamashita, M., Tsukahara, M., et al. (2021). Single-cell cloning of human induced pluripotent stem cells automation and protocol optimization. In International Society for Stem Cell Research.[5] Craig-Mueller, N., Hammad, R., Elling, R., et al. (2020). Modeling MyD88 Deficiency In Vitro Provides New Insights in Its Function. Front Immunol 11, 3327.[6] Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., et al. (2014). Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521–based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols 2014 9:10 9, 2354– 2368.[7] Kuo, H.H., Gao, X., DeKeyser, J.M., et al. (2020). Negligible- Cost and Weekend-Free Chemically Defined Human iPSC Culture. Stem Cell Reports 14, 256–270.
