自21世纪初，随着干细胞研究和组织工程的重大突破，类器官及其在显微成像中的应用取得了显著进展。已开发的多种类器官模型，如大脑、肝脏和肠道类器官，为研究器官发育、疾病机制揭示及治疗评估提供了新途径。同时，类器官成像技术的发展极大地促进了研究人员对这些复杂三维结构以细节和动态模式进行观察的能力。尽管如此，类器官研究仍面临多个挑战，包括维持样本活性、确保成像深度与分辨率，及处理和分析大量数据的需求。[1][2]
视频1.肺腺癌类器官样本，共聚焦四色成像，40x 甘油镜，拍摄厚度71微米（144层），样本来源伯桢生物bioGenous
DAPI-细胞核，CK7-细胞质，F-ACTIN-细胞膜，TTF1-细胞核（强增值性细胞）
共聚焦显微镜物镜的发展，特别是用于观察厚样本的物镜，对匹配样本和周围介质的折射率至关重要，否则会影响成像深度。高数值孔径的油浸物镜虽然提供高分辨率，但当用于水样本时由于折射率不匹配而面临限制，导致球面像差。这影响了能够有效成像的样本深度，并降低了图像质量。
图1.折射率
为了解决这些挑战，研究人员开始使用甘油作为一种折射率接近生物样本的介质，将样本置于甘油中，并使用甘油物镜进行成像。随着技术的进步，甘油物镜的设计和性能不断改进，成为现代显微镜中常见的物镜类型之一。
表1. 常见封片剂类型及其介质折射率的表格
封片剂类型 | 介质折射率 | 应用 |
水基封片剂 | 约1.33 | 水溶性样本，如染色后的细胞和组织切片 |
硅油 | 约1.40-1.41 | 活细胞成像和深度成像 |
VECTASHIELD®, ProLong®/ProLong® Gold | 约1.44-1.46 | 抗淬灭封片剂，长时间保持荧光稳定性和减少光淬灭影响 |
Fluoromount-GTM | 约1.45-1.47 | 常用的yongjiu性封片剂 |
Mowiol® 或PVA | 约1.41-1.49 | 用于荧光标记样本，提供良好的折射率匹配和稳定性 |
BABB, FocusClear, DBE | 约1.45-1.56 | 用于透明化样本的成像 |
如今，大多数固定样本都使用基于甘油的Mowiol、Vectashield或类似混合物进行封片。这些介质的折射率接近80/20甘油/水混合物的折射率（ne=1.45）。甘油物镜（介质折射率1.46）是在这种介质中封装的样本的更佳选择。
由于折射率匹配，甘油物镜减少了散射和光损失，在广泛的波长范围内都具有较好的透明度，提高了图像质量和信号强度，因此可实现更深的成像深度（见图3）。
图2. 甘油物镜与水镜成像效果对比（深度：200微米），样本来源伯桢生物bioGenous
配合校正环，我们还可以调整光学系统以适应封装介质的折射率变化，或者由于盖玻片厚度或温度变化引起的折射率变化。
在本期中，我们深入了解了类器官成像领域，共聚焦显微镜物镜的创新及其在观测厚样本中的重要应用。我们还探讨了如何通过选择与样本折射率相匹配的浸没介质来解决成像挑战。甘油物镜的应用充分证明了技术发展如何促进了成像质量和深度的提升，开辟了研究的新视野。
第二期我们将进一步探索类器官研究中的综合成像解决方案，涵盖自动化样本定位、高倍率成像的自动转换、三维结构的高分辨率成像，以及如何借助AI图像分析软件挖掘图像中的深层信息。
我们邀请您继续与我们同行，深入显微成像技术的新领域，共同揭开细胞与生物分子研究的新奥秘。敬请期待我们的下一期内容，将为您带来更多精彩洞见。
图3. 肺腺癌类器官样本，共聚焦成像，40x 甘油镜，DAPI-细胞核，F-ACTIN-细胞膜，样本来源伯桢生物bioGenous
