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细胞学堂 | 一文了解细胞爬片制作全过程

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2024/4/17 14:45:21


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细胞爬片是一种将细胞培养在玻璃或塑料表面上,使其附着并扩展的技术。一般是让玻片浸在细胞培养基内,使细胞在玻片上生长。这种技术可以用于观察细胞形态、运动、细胞与细胞之间相互作用等。利用细胞爬片进行体外实验可排除体内诸多干扰因素的影响,方便对细胞进行各种干预处理。


我们在做免疫荧光(IF)、原位杂交(FISH)、凋亡检测(TUNEL)等实验时,都需要制备细胞爬片,而爬片质量会影响到最后的图片呈现效果以及实验数据的精准性。本期细胞学堂为大家整理了细胞爬片的制作步骤及注意事项,帮助您快速上手开展实验。





操作步骤


01

爬片准备

1

根据实验选择合适大小的爬片。

2

爬片处理,首先浸酸:5%稀盐酸浸泡过夜(最好逐片浸入,多片同时浸入会引起多片粘连、浸洗不充分),第二天先用自来水冲洗20次,再用三蒸水冲洗2次(清除残留酸液)

3

将爬片置于无水乙醇浸泡过夜(浸洗脂类污渍),75%乙醇长期保存备用(无需高压灭菌)。使用时镊子取出爬片,酒精灯烘烤,放入孔板。


02

细胞爬片

1

收集贴壁细胞进行计数,按照实验需求用完-全培养基稀释细胞至合适浓度。

2

加细胞前,先在每个孔里准备放爬片的位置滴加少量培养基(目的是使爬片与培养皿靠液体的张力粘合到一起),然后轻放爬片(注意不要产生气泡,防止加细胞悬液时爬片漂起)整个过程注意无菌操作。

3

根据实验需求接种合适细胞量到培养器皿内。


03

爬片的固定

固定液的选择:

1)多聚甲醛(常用4%)

可用于免疫电镜、免疫组化、免疫荧光以及TUNEL染色等。室温固定15~30 min后可进行后续实验。


2)4%中性甲醛:

又名“10%中性福尔马林”,应用广泛,常用于免疫组化、免疫荧光以及TUNEL染色等。形态结构保存好,且穿透性强,但甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完-全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,可能造成假阴性的染色结果。室温固定15~30 min后可进行后续实验。


3)其他

如冷丙酮、75%~95%乙醇等,具体的以实验要求为准。


以多聚甲醛为例进行固定:

1

准备4%多聚甲醛(PFA),于4℃冰箱中保存,使用时常温复温。

2

在培养板中将已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次,每次3 min,轻轻晃动,避免将细胞冲掉。

3

用4%的多聚甲醛固定爬片15 min(细胞自带荧光时注意避光),PBS浸洗爬片3次,每次3 min

4

Triton X-100(PBS配制,浓度根据实验调整)室温通透20 min

5

PBS浸洗爬片3次,每次3 min

6

按实验需求进行后续实验。




04

细胞爬片封片

封片前根据实验需求决定是否需要孵育抗体或复染核。孵育好后用PBS浸洗3次,用吸水纸吸干爬片上的液体,封片液封片。






注意事项

固定好的细胞爬片建议尽快用于实验,以免影响实验效果。

取爬片时注意控制力度,夹取时尽量夹取爬片边缘,以免夹破爬片或造成划痕。

细胞爬片取出后,一般用PBS润洗3遍(润洗操作尽量轻柔,以免细胞脱壁;根据研究目的,可调整润洗次数,避免细胞脱壁),然后做固定。

对于贴壁性较差的细胞,可提前用包被液(明胶,多聚赖氨酸,鼠尾胶原等)包被爬片。

如果细胞带有荧光标记,所有操作步骤尽量在较暗处进行。

常见孔板细胞爬片(圆形)大小参考:

爬片尺寸

配套孔板

直径12 mm,厚度0.13~0.17 mm

24孔板

直径18 mm,厚度0.13~0.17 mm

12孔板

直径22 mm,厚度0.13~0.17 mm

6孔板







注:各个实验室的操作流程都各有差异。此方案是我们实践验证可行的方案。




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