中华人民共和国国家标准
农业部1077号公告-6-2008
水产品中玉米赤霉醇类残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of zeranols residues in aquatic products
by LC-MS/MS method
前言
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。
本标准起草单位：农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（哈尔滨）、哈尔滨市食品工业研究所。
本标准主要起草人：战培荣、孙言春、杨桂玲、陈忠祥、杨旭、覃东立、孙娜、卢玲、王海涛、赵彩霞、陆九韶。
1范围
本标准规定了水产品中玉米赤霉醇类残留量液相色谱串联质谱测定方法。
本标准适用于水产品中a -玉米赤霉醇β-玉米赤霉醇、a -玉米赤霉烯醇、β -玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮单个或多个混合物残留量的液相色谱-申联质谱检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
SC/T 3016水产品抽样方法
3原理
用乙腈提取试样中的六种玉米赤霉醇类，用正己烷脱脂，经过氨基固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱仪测定，色谱保留时间和质谱特征离子共同定性，外标法定量。
4试剂
以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，试验用水符合GB/T 6682一级水要求。
4.1 a-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、a-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮标准品，纯度均大于97%。
4.2乙腈：色谱纯。
1.3 正己烷：色谱纯。
4.4乙酸乙酯 ：色谱纯。
4.5 甲醇：色谱纯。
4.6 无水硫酸钠：640℃烘干4 h，干燥保存。
4.7正己烷-乙酸乙脂（60+ 40）：准确量取正己烷60 mL和乙酸乙酯40 mL，混匀。
4.8正己烷-乙酸乙酯（20+80）：准确量取正己烷20 mL和乙酸乙酯80 mL，混匀。
4.9 乙腈溶液（20%）：取20 mL乙腈，加水溶解，定容至100 mL。
4.10乙腈饱和的正己烷溶液：乙腈 100 mL中加入15 mL正己烷，混匀，备用。
4.11标准储备液（100 μg/mL） ：精确称取适量的a-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、a-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮，用甲醇分别配成浓度为100 μg/mL的标准储备液，-18℃冰箱中保存，贮存期1年。
4.12混合标准储备液（1.00 μg/ mL）：分别准确吸取1.0 mL的a -玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、a-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮标准贮备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容， -18℃冰箱中保存，贮存期6个月。
4.13混合标准工作溶液：准确吸取混合标准储备液，用乙腈溶液（4.9）稀释成浓度为0.50 ng/mL~100.00 ng/mL系列标准工作液，4℃暂时存放。
5仪器和设备
5. 1液相色谱-串联质谱联用仪（配电喷雾离子源）。
5.2涡旋混合器。
5.3离心机：4 000 r/min。
5.4分析天平：感量为0.01 g。
5.5分析天平：感量为0. 000 01 g。
5.6组织匀浆机。
5.7旋转蒸发仪。
5.8固相萃取装置。
5.9氮吹仪。
5.10鸡心瓶：100mL。
5.11具塞聚丙烯离心管：50 mL。
5.12具塞刻度玻璃管：10 mL。
5. 13氨基固相萃取柱：规格为500 mg，3 mL。
6测定步骤
6.1试样预处理
按SC/T 3016的规定执行。
6.2提取净化
称取（5.00±0.02）g试样于50mL离心管中，加入3g无水硫酸钠（4.6），润动20 s，加乙腈（4.2）15mL，充分均质混匀，4000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中。另取一50 mL离心管，加入10mL乙腈（4.2），清洗刀头。清洗液用来溶解上一步的残余物，重复提取一次，合并两次提取液。提取液中加入乙腈饱和的正己烷溶液（4.10）15 mL，充分震荡，3 0000 r/min离心5min，弃上层正己烷。再加乙腈饱和的正己烷溶液（4.10）10 mL重复脱脂一次。下层转至100 mL鸡心瓶中，50℃旋蒸至近干，加乙酸乙酯5 mL，涡动1min，静置30 s，上清液转移至50 mL离心管。鸡心瓶中加正己烷10 ml，涡动30s，静置30s，上清液转移至同一个离心管。再用正己烷10 mL洗涤鸡心瓶一次，合并三次残余物溶解液，备用。
氨基固相苯取柱依次用乙酸乙酯和正己烷各5 mL活化，取备用液全部过柱（流速不超过1 mL/min），再依次用正己烷、正己烷-乙酸乙酯（4. 7）各5 ml淋洗。依次用正己烷-乙酸乙酯（4.8）和乙酸乙酯各4 mL洗脱，合并两次洗脱液，50℃氮气吹干。
残余物用乙腈溶液（4.9）1.0mL溶解，涡动混匀，过0.2μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
6.3空白添加标准曲线的制备
分别精确取6种玉米赤霉醇类药物混合标准储备液适量，添加到5.00g空白试样中，制得浓度在0.00 μg/kg~ 100.00 μg/kg范围内的5~7个不同添加浓度的试样，按6. 2步骤操作，供液相色谱串联-质谱仪测定。
6.4测定
6.4.1色谱条件
a）色谱柱：BEH C18（2.1×50 mm，粒径1.7μm）；或相当者。
b）流动相：A相：水；B相：乙腈。
c）流速：0.3 mL/min。
d）柱温：35℃。
e）进样体积：10 μL。
f）流动相梯度洗脱程序见表1。
6.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源。
b）扫描方式：负离子扫描。
c）检测方式：多反应监测（MRM）。
d）电离电压：2.6 kV。
e）离子源温度：110℃。
f）雾化温度：380℃。
g）雾化气流速：600 L/h。
h）药物保留时间、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。
6.4.3 定性依据
在同样的测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间之间的相对标准偏差应在±5%以内，且监测到的离子的相对丰度，用与最强离子基峰的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致，校正标准可以是标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。基峰与次强碎片离子相对丰度比符合表3的要求。空白添加标准溶液的质量色谱图和玉米赤霉醇类药物子离子的质谱图见附录A中的图A.1~图A.7。
6.4.4 定量测定
按6.4.1和6.4. 2设定仪器条件，待仪器稳定后，取样品制备液和空白添加混合标准工作溶液进行测定，作单点或多点校准，外标法计算样品中药物的残留量，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。样品溶液及空白添加混合标准工作溶液中a-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、a -玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。
6.5 空白试验
除不加标样外，按照上述测定条件和步骤进行平行操作。
7结果计算
试样中玉米赤霉醇类的残留量按公式（1）计算，测定结果扣除空白值，保留三位小数：
单点校准：
或空白添加标准曲线校准：由As= aXs+b，求得a和b，代入公式（1）。
式中：
X——测试样品中玉米赤霉醇类的残留量，单位为微克每千克（μg/kg） ；
Xs——空白添加样品中相应玉米赤霉醇类的浓度，单位为微克每千克（μg/ kg）；
A——待测样品溶液中相应玉米赤霉醇类的峰面积，
As——空白添加样品溶液中相应的玉米赤霉醇类的峰面积；
ms——空白添加样品质量，单位为克（g）；
m——待测样品质量，单位为克（g）。
8方法灵敏度、准确度和精密度
8.1灵敏度
6种玉米赤霉醇类残留的检测限均为0.50μg/kg，定量限均为1.00μg/kg。
8.2准确度
本方法在添加浓度范围为1.00μg/kg~20.00μg/kg时的回收率为60%~120%。
8.3 精密度
本方法批间相对标准偏差<15%。批内相对标准偏差<15%。
