中华人民共和国国家标准
农业部958号公告-10-2007
水产品中雌二醇残留量的测定 气相色谱质谱法
Determination of estradiol residues in fishery products
Gas chromatography-mass spectrometry method
前言
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。
本标准起草单位：中国海洋大学。
本标准主要起草人：林洪、江洁、徐杰、邹龙、曹立民。
1范围
本标准规定了水产品中β-雌二醇残留量的气相色谱质谱测定方法。
本标准适用于水产品可食部分中β-雌二醇残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
酸性条件下，以乙腈提取样品中的β-雌二醇，经过正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，硅烷化试剂衔生化后，用气相色谱-质谱仪测定，内标法定量。
4试剂
4.1所有试剂应无干扰峰 ，除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682一级水指标。
4.2 β-雌二醇标准品：纯度≥97%。
4.3 β-雌二醇-D2标准品：纯度≥98%。
4.4乙腈：色谱纯。
4.5甲醇：色谱纯。
4.6正己烷：色谱纯。
4.7正丙醇。
4.8乙酸钠缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 5.2）：取0.2 mol/L乙酸钠溶液237 mL和0.2 mol/L乙酸溶液63 mL，混匀，用冰乙酸调至pH 5.2。
4.9乙酸溶液（0.1%）：取0.25 mL冰乙酸，加水溶解，定容至250 mL。
4.10 β-雌二醇标准贮备溶液：准确称取β-雌二醇0.01 g，用甲醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，使成浓度为100μg/ mL的标准溶液， -18℃存放，存放时间不超过6个月。
4.11 β-雌二醇-D2内标贮备溶液：准确称取β-雌二醇-D2 0.01 g，用甲醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，使成浓度为200 μg/ mL的标准溶液，-18℃存放，存放时间不超过6个月。
4.12 β-雌二醇标准工作溶液：临用前，准确吸取β-雌二醇标准贮备溶液，用甲醇稀释成浓度为0. 005μg/mL~0.25μg/mL标准工作液，4℃暂时存放。
4.13 β-雌二醇-D2内标工作溶液：临用前，准确吸取内标标准贮备溶液，用甲醇稀释成浓度为0.05 μg/mL标准工作液，4℃暂时存放。
4.14衍生化试剂：准确称取0.01 g二硫赤藓糖醇（DTE），溶解于5 mL N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），然后在液面下加入10μL三甲基碘硅烷（TMIS），混匀，4℃放置过夜后使用，避光防潮密封保存、行生化试剂应是无色，如果发生棕红色等颜色变化，表明试剂失效。
5仪器
5.1气相色谱单四极杆质谱联用仪：配备电子轰击电离（ EI）离子源。
5.2电子天平：感量0.0001g。
5.3旋涡混合器。
5.4高速冷冻离心机：最大转速10 000 r/min。
5.5固相萃取仪。
5.6氨吹仪。
5.7具塞离心管：50 mL。
5.8鸡心瓶：50 mL。
5.9具塞刻度玻璃管：10 mL。
5.10 C18固相萃取柱：填料500 mg，3 mL，选用Cleanert ODS C18（封端），或相当者。
5.11样品反应瓶：2 mL，去活，螺纹口。
6测定步骤
6.1样品预处理
取水产品可食部分，切为不大于0. 5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，充分匀浆，冷冻保存备用。
6.2提取
称取样品5g（精确到0.01g）于50mL具塞离心管中，加入100μL内标工作溶液，再加入5mL乙酸钠缓冲溶液（4.8），均质1 min后，加入10 mL乙腈，旋涡混合1 min，超声提取15 min。取出离心管，10 000 r/min 4℃离心10 min，上清液倒入另一50 mL具塞离心管中。残渣中加入10 mL乙腈，按上述方法再提取一次，上清液合并于50 mL离心管中。
注：均质机清洗方法，先用大量水浸洗.再用乙腈浸洗，最后用蒸馏水浸洗。
6.3脱脂
向盛装上清液的离心管中加入10 mL正己烷，加塞剧烈振荡1 min~2 min， 10 000r/min 4℃离心5 min，用滴管吸弃上层正己烷层。再加入10 mL正己烷，按上述方法重复洗涤一次 ，所得溶液转移至鸡心瓶，加入0. 5 mL正丙醇，摇匀，于45℃水浴条件下减压旋转蒸发至干残渣中加入1 mL乙腈，超声波清洗瓶壁1 min后，用5 mL注射器吸取，重复上述操作，合并乙腈至5mL注射器，用针头过滤器经有机系滤膜过滤至10mL具塞刻度玻璃管中，加水至10mL，旋涡混匀。
6.4 C18柱净化
C18固相萃取柱，顺序用6 mL甲醇、3 mL乙酸溶液（4.9）和3 mL.水清洗并活化，弃掉洗涤液。吸取待测溶液（6.3）过柱，弃掉流出液。用3 mL水洗涤C18柱，弃掉流出液。再用9 mL乙腈洗脱，将洗脱液接收至10mL玻璃管中，于50℃下氮气吹至约1mL，用滴管吸至样品反应瓶中，用0.5mL乙腈洗玻璃管，合并至同一样品反应瓶中，氮气吹干，应防潮。
注意：以上步骤应连续做完，不应让吸附剂变干，过柱的流速保持1 mL/min~2 mL/min。
6.5衍生化
6.5.1试样的行生化
向吹干的残留物中准确加入100μL衍生化试剂（4.14），盖紧塞子并旋涡混合1min，在60℃烘箱中反应30 min，冷却至室温，于48 h内进行气相色谱-质谱分析。
6.5.2标准溶液的衍生化
吸取一定量的β-雌二醇标准工作溶液和100 μL内标标准工作溶液于样品反应瓶中，氮气吹干，以下按6.5.1的步骤操作。
6.6测定
6.6.1色谱条件
色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱，固定相（5%苯基）-甲基聚硅釵烷，25 m×0.32 mm×0.52 μm；或与之相当的色谱柱。
载气：高纯氦气.纯度≥99.99%，流速1. 0 mL/min。
进样口温度： 250℃。
进样方式及进样量：不分流进样，1μL。
升温程序：初始柱温120℃，保持2min，然后以15℃/min，升至250℃，再以5℃/min升至300℃，保持5 min。
6.6.2质谱条件
离子源：EI源，电离能量70 eV。
离子源温度：230℃。
四极杆温度：150℃。
接口温度：280℃。
溶剂延迟：3 min。
扫描质量范围：40 amu~500 amu。
选择离子监测（SIM）：β-雌二醇衍生物（m/z）：416、326、285、232；β-雌二醇-D2衍生物（m/z）：418、328、287、234。
6.6.3气相色谱质谱分析
6.6.3.1定性方法
样品峰与标准的保留时间之差不多于0.10min，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均出现，并且样品峰的各选择离子相对强度与标准相应选择离子相对强度相一致时（参见附录图A1、A2） ，可以判断检出β-雌二醇。在6.6.1和6.6.2规定的条件下， β-雌二醇和内标β-雌二醇-D2衍生物的特征离子、特征离子相对强度和允许相对偏差应符合表1要求。
6.6.3.2定量方法
以β-雌二醇衍生物定量离子（m/z 416）与β-雌二醇-D2衍生物定量离子（m/z 418）质量色谱图（见附录图A3）的峰面积比单点或多点校准定量。当单点校准定量时根据样品溶液中β-雌二醇含量情况，选择峰面积相近的标准工作溶液进行定量，同时标准工作溶液和样品液中β-雌二醇响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
7计算
样品中β-雌二醇的含量按公式（1）计算：
式中：
X——样品中β-雌二醇含量，单位为微克每千克（μg/ kg）；
Cs——标准工作溶液中β-雌二醇含量，单位为微克每毫升（μg/ mL）；
A——试样液中β-雌二醇与β-雌二醇-D衍生物定量离子的峰面积比值；
V——样品最终体积，单位为毫升（mL）；
As——标准工作溶液中β-雌二醇与β-雌二醇-D2衍生物定量离子的峰面积比值；
m——样品质量，单位为克（g）。
8方法回收宰
本方法的回收率≥60%。
9方法检测限
本方法检测限：0.5μg/kg。
10方法精密度
本方法相对标准偏差≤15%。
11方法的线性范围
本方法的线性范围：0.005μg/mL~0.25μg/mL。
