上海恒光智影医疗科技有限公司
2024/7/23 14:51:38本文要点:在NIR-II区域表现出强吸收性的材料对基于光热转换的成像、诊断和治疗具有吸引力,因为该区域具有更好的热效应和更少的水吸收。3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (TMB) 是 ELISA 中的典型底物,因其氧化产物 (oxTMB) 在 NIR 区域具有光热活性,因此已在光热免疫测定中进行了探索。然而,它在 1064 nm(光热研究中激光波长)处的吸收并不明显,因此限制了灵敏度的测定。在这里,我们提出了TMB(3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基联苯胺,2-OCH3)在1064 nm激发光热免疫测定中具有更高的NIR-II吸收。由于供电子基团可以帮助减少分子的能隙(这里是 -CH3→ -OCH3),2-OCH3的氧化产物与oxTMB相比,表现出显著的红移吸收,导致在1064 nm处的吸收系数高出两倍以上。因此,2-OCH3在光热免疫测定 (PTIA) 中显示出比 TMB 更高的灵敏度,前列腺特异性抗原 (PSA) 的检测限 (LOD) 为 0.1 ng/mL。2-OCH3的可行性通过分析 61 份血清样本中的 PSA,进一步验证了基于 PTIA 的诊断。考虑到其优异的光热性能,2-OCH3可以探索广泛的光热应用。
光热效应是指将光能转化为热能,表现出这种效应的材料在生物检测中得到了广泛的应用。3′3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)是ELISA中占主导地位的显色底物,已广泛应用于各种分析检测过程,其中 TMB在HRP催化剂(HRP-抗体偶联物)存在下被 H2O2氧化。本文提出了一种新的TMB衍生物,该衍生物增强了其单电子氧化产物的NIR-II吸收,用于改进光热免疫测定(PTIA)。具体而言,将供电子甲氧基团引入TMB框架的3-、3'-、5-和5'-位置,导致占据分子轨道(HOMO)和未占据分子轨道(LUMO)之间的带隙变窄,从而产生红移吸收。两种候选衍生物,即3,3′,5,5′-四甲氧基联苯胺(2-OCH3)和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基联苯胺(4-OCH3),进行了测试。在 NIR-II 窗口内的 1064 nm 处,2-OCH3的单电子氧化产物, 2-OCH3·+,具有出色的光热转换效率 (η = 28.8%) 和 1.48 × 104M-1cm-1的摩尔吸收系数 (ε),表现出优于 TMB 的性能。当应用于 PTIA 时,2-OCH3前列腺特异性抗原(PSA)的检测限(LOD)为0.1 ng/mL,是TMB(LOD,0.27 ng/mL)的2.7倍。2-OCH3 的精度基于 PTIA 的 61 份血清样本也得到了验证,显示了其在医学诊断中的潜力。
图1. 具有增强 NIR-II 吸收的 TMB 衍生物的设计和验证
为了提高1064nm处的吸光度,需要吸收的红移。电子供体基团的引入有助于减小占据分子轨道(HOMO)和未占据分子轨道(LUMO)之间的能隙,从而产生红移吸收和发射。首先利用理论计算来预测原始衬底(TMB及其衍生物)及其单电子氧化产物(图1A)的光谱特性。合成两种TMB衍生物,即3,3′,5,5′-四甲氧基联苯胺(2-OCH3)和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基联苯胺(4-OCH3)。随后,TMB和合成衍生物的实验结果证实了上述光谱学预测,即观察到2-OCH的明显红移吸收3和 4-OCH3在TMB上(图1D)。将反应置于 H2O2-HRP氧化后,相应氧化产物的吸收也大大红移(图1E)。例如,2-OCH的摩尔消光系数3(ε = 1.48 × 104M-1cm-1)在1064 nm处比TMB高两倍以上(ε = 6.06 × 103M-1cm-1)。因此,这种简单的结构修饰有效地增强了TMB在1064 nm处的吸收,从而在理论上改善了衍生物的光热响应。
图2. 基底的光热性能
接下来,用红外热像仪进行评估TMB,2-OCH3和 4-OCH3(之后 H 2O2-HRP氧化)的光热能力。为了实现这样的目标,在功率密度为1.2 W/cm2 的 1064 nm 激光器下暴露50秒。如图 2A所示,2-OCH3和 4-OCH3温度分别上升了21.7和19.3 °C,大大高于TMB(11.7 °C)。详细测试表明,在 1064 nm 处,2-OCH3的光热响应较强可归因于其高光热转换效率(η=28.8%,图2B,C)和摩尔消光系数(ε = 1.48 × 104M-1cm-1)。在连续五个激光开/关循环中,2-OCH3相对标准差 (RSD) 为 1.6%(图 2E),也比 TMB (RSD = 3.58%,图2D)更稳定。当比较信噪比时,2-OCH3在 TMB 和 4-OCH3中均表现出性能 (图2)此外,2-OCH3的氧化在不同量的HRP存在下具有高度的可重复性,表明2-OCH3是免疫测定的良好底物。因此,2-OCH3被选中进行进一步调查。
图3. 2-OCH3 氧化产物在 HRP-H2O2 系统中的表征
2-OC3的氧化产物可以以两种形式呈现:单电子氧化产物(2-OCH3·+),也称为电荷转移复合物 (CTC) 和二亚胺二酰胺二分化 (2-OCH3+2).先前的研究表明,如果受体的电子亲和力(ΔE)超过了供体(S)的HUMO和受体(S)的LUMO之间的能隙(ΔE)2+),电荷转移将导致CTC的形成(图3A)。证实了2-OCH3的氧化产物在 HRP-H2O2系统中确实是 2-OCH3·+,在NIR-II区域表现出很强的吸收性,以改善光热应用。
图4. 2-OCH3 基于 PSA 检测的 PTIA
在2-OCH3氧化产物具有优异光热性能的基础上,评价了其在PTIA中的可行性。为了实现这一目标,PSA被用作模型分析物,PTIA的构建是通过在商业PSA试剂盒中用2-OCH3简单地取代TMB来实现的(图4A)。在PSA检测之前,研究了一系列参数,包括pH、H2O2浓度、样品体积、激光照射时间和缓冲液,以获得光热响应。在条件下,温度响应与PSA浓度在0.31−20 ng/mL范围内呈线性关系(图4B)。建立的相关方程为y=1.19x+3.47,相关系数为0.995(图4B)。与TMB(LOD,0.27 ng/mL)相比,在PTIA中使用2-OCH3(LOD:0.1 ng/mL)显示出2.7倍的灵敏度提高,从而证实了2-OCH3在PTIA性能。与ELISA类似,基于2-OCH3的PTIA也表现出优异的特异性(图4C)和长期稳定性。
为了探索基于2-OCH3的PTIA的普遍性,还选择CEA、IgG和GPC-3作为分析物进行额外验证。与PSA测定类似,通过用2-OCH3取代TMB来调整用于这些分析物的市售试剂盒。、此外,对于所有这些分析物,观察到比TMB底物更高的灵敏度。这些结果不仅证明了2-OCH3光热效率,而且揭示了基于2-OCH3的PTIA在临床诊断中的多功能性。
图5. 用基于 PTIA 的 2-OCH3 检测血清样本中的人 PSA
人类血清中PSA的检测。通过检测临床血清样本中的PSA,验证了基于2-OCH3的PTIA的诊断能力。为了实现这一目标,共收集了61份血清样本,其中20份来自健康个体,41份来自诊断为前列腺癌症的患者(表S6),并进行了PTIA和ELISA检测。如图5A所示,从两种方法获得的结果之间存在高度相关性。受试者操作特征(ROC)分析显示,PTIA(0.987)的曲线下面积(AUC)略好于ELISA(0.963),表明PTIA对前列腺癌症诊断具有良好的准确性(图5B)。根据ROC曲线,ELISA和PTIA的诊断阈值分别为3.3 ng/mL和2.58 ng/mL。混淆矩阵分析表明,PTIA的灵敏度为92.7%(图5D),而ELISA的灵敏度为85.4%(图5C)。这些结果证实了基于2-OCH3的PTIA在临床诊断中的潜力。此外,在3周内对同一样品进行重复分析后,发现RSD为8.1%,表明基于2-OCH3的PTIA具有良好的稳健性。
本研究提出了一种新的光热试剂(2-OCH3)基于用甲氧基取代TMB的甲基。与TMB相比,2-OCH3的单电子氧化产物表现出更高的摩尔消光系数 (ε = 1.48 × 104M-1cm-1),从而产生高效的光热转换效率(η = 28.8%)。2-OCH3是TMB的衍生物,可直接替代目前ELISA试剂盒中的TMB进行光热免疫测定。在 PTIA 应用中,2-OCH3在1064 nm激光器的刺激下,表现出比TMB更高的信噪比和灵敏度。由于信号读出的简单性和临床应用潜力,2-OCH3可作为基于 PTIA 的诊断的基材。考虑到2-OCH3出色的光热性能TMB,在光热疗法中2-OCH3的应用前景广阔,也可以预期成像和其他相关应用。
参考文献
Henglin Liu, Xiao Zhang, Xianming Li, and Peng Wu. NIR-II-Absorbing TMB Derivative for 1064 nm-Excited Photothermal Immunoassay. Analytical Chemistry 2024 96 (14), 5633-5639
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