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内容

1.化学
2.液相合成
3.固相合成
3.1.中国银行SPPS
3.2.Fmoc SPPS
4.固体支持物
4.1.聚苯乙烯树脂
4.2.聚酰胺树脂
5.保护团体
5.1.Fmoc保护基团
5.2.Boc保护基团
5.3.苄氧羰基(Z)基团
5.4.Alloc保护基团
5.5.平版保护基团
6.激活组
6.1.碳化二亚胺
6.2.芳香肟
7.合成长肽
8.固相肽合成的一个例子
9.参考

1.化学

肽是通过将一个氨基酸的羧基或C端偶联到另一个氨基酸的氨基或N端而合成的。

2.液相合成

液相肽合成是肽合成的经典方法。在大多数实验室中，它已被固相合成所取代(见下文)。然而，它在用于工业目的的肽的大规模生产中仍然有用。

3.固相合成

Merrifield固相肽合成(SPPS)导致了肽合成领域的范式转变。这是目前实验室以合成方式制造肽和蛋白质的方法。SPPS允许合成难以在细菌中表达的天然肽、掺入非天然氨基酸、肽/蛋白质骨架修饰以及合成由D-氨基酸组成的D-蛋白质。

小珠子用接头处理，在接头上可以构建肽链。合成珠将保持与肽的强结合，直到被试剂裂解。珠子创造了一种合成环境，在这种环境中，产生的肽链不会通过过滤材料，而用于产生肽链的试剂会通过。

重点考虑在每一步中产生高的产量。例如，如果每个步骤具有99%的产率，26个氨基酸的肽将以77%的最终产率合成，如果每个步骤是95%，它将以25%的产率合成。因此，每一种氨基酸都是以大大过量(2 ~ 10倍)添加的，并且通过一系列充分表征的试剂将氨基酸偶联在一起是高度优化的

有两种主要的SPPS形式——Fmoc和Boc。与核糖体蛋白质合成不同，固相肽合成以C-末端到N-末端的方式进行。氨基酸单体的N-末端被这两个基团保护，并被加到去保护的氨基酸链上。

自动合成器可用于这两种技术，尽管许多研究小组继续手动执行spp。

SPPS受到产量的限制，通常70~100个氨基酸范围内的肽和蛋白质正在推动合成可及性的极限。合成难度也依赖于序列；典型的淀粉样肽和蛋白质很难制造。通过使用天然化学连接将两个肽偶联在一起，可以获得更长的长度，并具有定量的产量。

3.1.中国银行SPPS

当R. B. Merrifield在1963年发明SPPS时，它是根据tBoc方法。t-Boc(或Boc)代表叔丁氧羰基。为了从生长的肽链上去除Boc，使用酸性条件(通常是纯TFA)。在合成结束时，通过在氢氟酸中孵育(这可能是危险的)，从树脂中除去侧链保护基团和肽；由于这个原因，Boc化学通常不受欢迎。然而，对于复杂的合成，Boc是有利的。当合成对碱基敏感的非天然肽类似物(如depsi肽)时，Boc是必需的。

4.固体支持物                        

固相支持物的物理性质及其可用于的应用，随着构建支持物的材料、交联的量以及所用的接头和手柄而变化。

4.1.聚苯乙烯树脂

这是一种多功能树脂，由于其在DCM中的溶胀最小，因此在多孔自动化肽合成中非常有用。

4.2.聚酰胺树脂

这也是一种有用和多用途的树脂。它似乎比聚苯乙烯膨胀得多，在这种情况下，如果孔太小，它可能不适合一些自动合成器。

5.保护团体

由于在每个合成步骤中使用过量的氨基酸来确保偶联，在每个氨基酸未被保护的反应中，氨基酸的聚合是常见的。为了防止这种聚合，使用了保护基团。这给合成反应增加了额外的去保护阶段，产生了如下的重复设计流程:

• 在去保护反应中，保护基团从尾部氨基酸中被除去

• 洗去脱保护试剂以提供清洁的偶联环境

• 溶解在溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)中的受保护的氨基酸与偶联剂混合，泵送通过合成柱

• 洗去偶联试剂以提供干净的去保护环境

目前，固相肽合成中通常使用两种保护基团(Fmoc，Boc)。它们的不稳定性是由氨基甲酸酯基团引起的，氨基甲酸酯基团容易释放CO2用于不可逆的解偶联步骤。

5.1.Fmoc保护基团

Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)是目前广泛使用的保护基团，其通常在从氨基酸单元重复合成肽的过程中从肽的N末端除去。Fmoc的优点是它在非常温和的碱性条件下(例如哌啶)被裂解，但在酸性条件下稳定。这使得在碱性条件下稳定的温和的酸不稳定保护基团，例如Boc和苄基，被用于目标肽的氨基酸残基的侧链上。这种正交保护基策略在有机合成领域很常见。

5.3.苄氧羰基(Z)基团

另一种基于氨基甲酸酯的基团是苄氧羰基(Z)基团。它在更苛刻的条件下被去除:溴化氢/乙酸或催化氢化。今天，它几乎用于侧链保护。

5.4.Alloc保护基团

当需要邻位去保护方案时，烯丙氧基羰基(alloc)保护基团通常用于保护羧酸、羟基或氨基。有时在进行树脂上环肽形成时使用，其中肽通过侧链官能团与树脂连接。可以使用四(三苯基膦)钯(0)以及氯仿、乙酸和N-甲基吗啉(NMM)的37∶2∶1混合物2小时来除去alloc基团。然后，必须用0.5 % DIPEA的DMF溶液、3×10ml 0.5%二乙基硫代氨基甲酸钠的DMF溶液以及5×10ml 1:1 DCM:DMF溶液仔细清洗树脂。

5.5.平版保护基团

对于特殊应用，如蛋白质微阵列，使用平版印刷保护基团。这些基团可以通过曝光去除。

6.激活组

为了偶联肽，羧基通常被活化。这对加速反应很重要。有两种主要类型的活化基团:碳二亚胺和芳香肟。

6.1.碳化二亚胺

这些活化剂最初是被开发出来的。最常见的是二环己基碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)。与羧酸反应生成高活性的O-酰基脲。在人工蛋白质合成过程中(如Fmoc固态合成仪)，C末端通常用作氨基酸单体添加的附着位点。为了增强羧酸基团的亲电性，带负电荷的氧必须首先被“活化”成更好的离去基团。DCC用于此目的。带负电荷的氧将充当亲核试剂，攻击DCC中的中心碳。DCC暂时连接到以前的羧酸酯基团(现在是酯基团)，使得氨基(在连接的氨基酸上)对以前的C-末端(碳酰基)的亲核攻击更有效。碳二亚胺的问题是它们反应性太强，因此会导致氨基酸的外消旋化。

最新的发展省略了碳二亚胺。活性酯作为非亲核阴离子(四氟硼酸盐或六氟磷酸盐)的脲盐或鏻盐引入:HBTU、HATU、PyBOP。

7.合成长肽

逐步延伸，其中氨基酸逐步依次连接，对于含有2至100个氨基酸残基的小肽是理想的。另一种方法是片段缩合，其中肽片段被偶联。虽然前者可以延长肽链而不发生外消旋化，但如果仅用于产生长肽或高极性肽，产量会下降。对于合成复杂的长肽来说，片段缩合比逐步延伸更好，但是为了防止外消旋化，必须限制它的使用。片段缩合也是不希望的，因为偶联的片段必须大大过量，这可能是一个取决于片段长度的限制。

产生更长肽链的一个新进展是化学连接:未保护的肽链在水溶液中发生化学选择性反应。第一个动力学控制的产物重排形成酰胺键。最常见的天然化学连接形式使用与末端半胱氨酸残基反应的肽硫酯。

8.固相肽合成的一个例子

以下是使用碱不稳定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团在聚酰胺或聚苯乙烯树脂上合成肽的合成步骤的概述。使用下面概述的技术，将获得在N-末端用乙酰基封端，在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。

为手动肽合成设置玻璃器皿

手动肽合成可以在具有三通阀的烧结过滤器反应容器中完成，该三通阀通过1孔塞子安装在1 L侧臂真空烧瓶上。一个阀门用于充入氮气，氮气首先通过一个小的Drierite柱，然后进入反应混合物以搅拌溶液和混合试剂。另一个阀门用于排空过量的反应溶液，并使用真空瓶洗涤溶剂。用于固相合成的所有玻璃片应在使用前用硅烷化试剂(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)处理，以避免静电荷的积累，静电荷的积累会使树脂很难处理。

聚酰胺树脂的制备

聚酰胺(PL-DMA)树脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在摇床上处理过夜，然后过滤，用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗涤，并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸盐(PyBOP) (3 eq)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二异丙基乙胺(DIPEA)装载Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥，并储存在-15摄氏度，直到需要。

在合成前和合成过程中处理树脂

树脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶胀15分钟，然后沥干。每次完成氨基酸偶联后，还用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗涤树脂。

Fmoc-去保护

每次氨基酸偶联后，用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液进行Fmoc去保护，每次处理用N2搅拌10分钟。然后用5×10毫升DMF洗涤树脂，接着用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗涤。

添加氨基酸

为了在Fmoc-聚酰胺-Rink树脂上开始肽合成，通过用哌啶处理树脂来除去Fmoc基团。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)将第一个氨基酸偶联至树脂的Fmoc-去保护的N-末端胺，或之前偶联的氨基酸，直到树脂对茚三酮呈阴性。

监测氨基酸偶联的进展

氨基酸偶联的过程可以用茚三酮或对氯醌来跟踪。茚三酮溶液在游离伯胺的存在下变成深蓝色(阳性结果)，但在其他情况下是无色的(阴性结果)。如果使用乙醛作为溶剂，在伯胺的存在下，或者如果使用丙酮，在仲胺的存在下，对-氯醌溶液将使树脂珠变成深黑色或蓝色；否则珠子保持无色或淡黄色。(测试概述如下)

茚三酮测试(1)

向微量离心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液，以及抹刀一端大小的树脂样品，然后涡旋混合物，并在100°c下加热5分钟

用氯醌测试(2)

向微量离心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴对氯醌的甲苯饱和溶液，以及小刮刀一端大小的树脂样品，然后涡旋混合物，并在室温下静置5分钟。丙酮用于检测仲胺，乙醛用于检测伯胺。

持续肽延伸

一旦氨基酸的偶联完成，就洗涤树脂，用哌啶去保护Fmoc基团，并再次洗涤树脂，为下一次偶联做准备。重复这一过程，直到添加完所有必需的氨基酸。

乙酰化N-末端

肽序列完成后，可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙酰化N-末端胺1小时或直到茚三酮阴性，然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗涤树脂，然后将肽从树脂上切下。如果需要，N-末端也可以作为游离胺留下。

从树脂上切割肽

用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三异丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)处理树脂，每次处理10分钟，然后过滤掉树脂，将合并的滤液静置1小时，以确保除去酸不稳定的保护基团。

从树脂上切割后肽的处理

将TFA在旋转蒸发器上蒸发至干(或重油或玻璃，如果它不凝固的话)，随后向烧瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽，并除去大部分副产物。将肽和乙*的悬浮混合物加入到50 ml Falcon管中，并以3000 rpm的速度旋转10-20分钟(IEC离心机),直到可以倒出乙*而不损失任何肽。加入更多的后，通过涡旋使肽重新悬浮。再次离心混合物，倒出，洗涤过程重复两次以上。最后，产品可以在脱粘器中的Falcon管中风干过夜。

通常使用制备型HPLC来纯化最终产物。获得质谱数据以确保获得目标肽。