细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础。其中,细胞传代是将部分细胞分离出来,重新接种到新的培养皿中,使细胞重新获得足够的营养条件和生长空间的过程。对于贴壁生长的细胞,细胞密度长到80%-90%时,细胞状态最好,此时可进行细胞传代。下面让我们一起来看看贴壁细胞传代的方法和注意事项吧!
一、贴壁细胞传代(以T25瓶为例)
1.显微镜下观察细胞汇合度大于80%即可传代;
2.将移液管、移液枪、T25培养瓶、1ml枪头、PBS溶液等放入超净工作台,紫外灯灭菌30min后再通风30min;
3.培养基放置37℃水浴锅预热;
4.将胰酶和培养基用75%酒精消毒后放入超净工作台;
5.在培养箱内旋紧培养瓶瓶盖,拿出细胞,用75%酒精消毒后放入超净工作台;
6.吸弃上清液;
7.用5mlPBS液润洗细胞,吸弃PBS;
8.培养瓶加入1ml胰酶,轻轻晃动使胰酶充分覆盖细胞层,放入培养箱中孵育;
9.在显微镜下观察细胞解离状况,细胞明显变圆、细胞间隙增大,轻轻晃动可呈现流沙状即可终止;
10.加入4ml培养基终止消化,吹打细胞层表面数次,使其分散成单个细胞;
11.收集细胞悬液到50ml离心管中,1000-1200r/min离心,3-5min去除胰酶;
12.离心管用75%酒精消毒后放入超净工作台,吸弃上清液,用新鲜培养基重悬细胞;
13.将细胞悬液按推荐传代比例分装到培养瓶,补充适量培养基,摇晃使细胞分布均匀,并做好标记;
14.在显微镜下观察细胞密度及状态,把细胞放回培养箱,旋松瓶盖以便进行气体交换。
二、注意事项:
1.PBS润洗细胞时,从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入PBS,避免冲刷到细胞层;
2.不同细胞的胰酶所需消化时间不一样,消化时间根据细胞贴壁特性而定,可每30s观察一次。
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