你知道如何去除重组蛋白的融合标签吗？来看看吧！

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百欧博伟生物：由于基因工程技术的发展，人们可以自由地将各种基因进行随意的进行组合，表达出多种功能的蛋白质。蛋白融合标签技术作为 DNA 重组技术的代表，通过在基因水平上改造目标蛋白，产生含有融合标签的重组蛋白，兼具了原有蛋白质的功能活性和融合标签所的生理生化特性。随着蛋白药物的飞速发展，融合标签技术被广泛地应用于科研及医药工业领域，尤其在蛋白质分离纯化、膜蛋白结构研究、蛋白质生化功能研究等方面有着重要作用。

虽然融合标签具有十分多的优点，可以使蛋白的纯化更加的快捷方便、能够促进目的蛋白的正确折叠和可溶表达、利于蛋白质的表达和定位等；但是有时对目标蛋白也会造成不利影响。其主要表现在：①融合标签可能会影响目标蛋白的构象。例如蛋白连接GST标签后，虽然蛋白质的可溶性增加了，但是蛋白质构象却发生了很大的变化。因此，在研究蛋白质结构时，需要移除融合标签，排除融合标签对蛋白质结构的影响；②融合标签可能会抑制和影响目标蛋白的活性。例如，对用于癌症治疗的单抗 CC49 单链 Fv 片段(scFv)的研究表明，当多聚组氨酸标签与 scFv 的 C 端相连接时，会对 scFv 部分抗原结合位点进行覆盖，从而降低 scFv 对抗原的结合能力。

在研究蛋白质或酶的性质或功能时，往往需要考虑融合标签的对其是否有影响。对于药用蛋白质，融合标签可能会对目标蛋白的药效产生不利影响，此外还会对人体健康存在潜在影响，因而很有必要将融合标签进行去除。

移除融合标签最长常用的方法可分为：化学法、外切蛋白酶法、内切蛋白酶法和基于内含肽的自我剪切法。

一、化学法

化学方法移除多肽标签所采取的基本策略为：在目标蛋白与融合标签之间插入一个甲硫氨酸残基，蛋白被诱导表达和纯化后，用溴化氰或羟胺处理该融合蛋白，使目标蛋白与融合标签在插入的甲氨酸残基处断裂，从而使标签和目标蛋白分开。

溴化氰(CNBr)解法是多种化学法中最重要的也是见的方法。由Gross和witkop于1962年建立的，后人进行了系统研究，能专一裂解甲硫氨酸残基的羧基端，产率达到85%。由于蛋白质中的甲硫氨酸含量一般都比较少，因此裂解后的肽段较少，新生成的肽段往往是大肽段。

化学法的优点：化学法具有效率高、耗时短、成本低等。缺点：所需的反应条件容易破坏目标蛋白的结构和功能，而且所使用的溴化氰等试剂具有毒性，此法不适合于药用蛋白；如果目标蛋白含有内源甲氨酸残基，会发生非特异性断裂，导致目标蛋白被破坏；此外，化学法切割时容易产生副反应，会对一些氨基酸侧链进行修饰从而改变目标蛋白本来的性质。

二、外切蛋白酶法

外切蛋白酶能够从蛋白质的 N 端或 C 端开始，依次切除一个或几个氨基酸残基，直到遇到某种特定的氨基酸残基才会停止切割。外切蛋白酶的种类包括氨基肽酶和羧基肽酶，分别可以切除蛋白的 N 端和 C 端的融合标签，例如氨基肽酶M (APM)和羧肽酶 A和B(CPA和CPB)等。

对于外切蛋白酶法切除融合标签应用中，代表性的是基于二肽氨基肽酶(DPPI，商品名为DAPase)的作用机理所提供的 TAGZyme 系统，用于去除 N 端的多聚组氨酸标签。DAPase 能够从蛋白质 N 端依次切除二肽，当蛋白的 N 端出现 Lys、Arg、Gln 残基，或者在 N 端第2个或第3个氨基酸残基是Pro时，切除反应终止，酶切完成。

外切蛋白酶的作用独立于目标蛋白内部的序列，不会造成非特异性切割，几乎可以适用于任何目标蛋白。外切蛋白酶完成酶切的时间相对较短，也降低了造成目标蛋白变性失活可能性。外切蛋白酶完成酶切所需酶量也少于内切蛋白酶的用量，不但减少了非特异性切割的风险，还降低了后续去除该酶的难度。

三、内切蛋白酶法

内切蛋白酶能够识别蛋白质的特定氨基酸序列，并从该序列内部或附近的特定氨基酸残基处进行切割。使用内切蛋白酶时的一般策略：①选择合适的内切蛋白酶，注意目标蛋白内部有多余的酶切位点；②构建表达载体时，在融合标签与目的蛋白之间引入内切蛋白酶识别序列；③构建质粒、导入宿主并诱导表达、分离纯化重组融合蛋白；④内切蛋白酶对融合蛋白进行酶切；⑤再次纯化，去除内切蛋白酶和融合标签。

在利用内切蛋白酶去除融合标签时，内切蛋白酶的特异性和酶切效率主要受 3 种因素影响：①内切蛋白酶固有的非特异性酶切。如 Factor Xa 和凝血酶通常具有第二切割位点，并且第二位点的切割效率会随着反应条件的不同而变化。非特异性切割可以通过优化反应条件减少，但不能消除 ，因此在优化条件时，需要检测切割后的产物，以确定目标蛋白产物的均一性；②目标蛋白的结构。当融合蛋白的酶切识别位点位于蛋白质三维结构的内部时，内切蛋白酶活性中心难以识别到该位点，致使酶切效率变低。如在使用肠激酶对处于聚集状态的目标蛋白所含的多聚组氨酸标签的切除时，只有使目标蛋白的肠激酶的切割识别位点暴露出来后，才能获得较高的酶切效率。③溶液中化学成分对酶切活性会产生影响，如去垢剂。在纯化跨膜蛋白时，通常需要加入去垢剂，可能会影响内切蛋白酶的酶切效率。

在利用内切蛋白酶切除融合标签之后，通常需要将内切蛋白酶除去掉。因此在内切蛋白酶时，尽量选取含有亲和标签的内切蛋白酶，在酶切完成后，通过二次过柱使带亲和标签的内切蛋白酶吸附在柱上，而目标蛋白则洗脱下来。

四、基于内含肽的自我剪切法

内含肽(intein)是前体蛋白中的一段插入序列，能够自我催化蛋白质的剪接(protein splicing)，使自身从前体蛋白中切除，并将两侧的外显肽(extein)连接形成成熟的蛋白。

相比于化学法，自我剪切法条件温和，不会导致目的蛋白的变性。相对传统的酶切法需要多次过柱纯化（不仅需要分离融合蛋白还需除去蛋白酶及融合标签），自我剪切法简化了纯化过程，节约了成本和时间。 此外，自我剪切法具有良好的特异性，一般只在剪接位点的氨基酸残基上发生切割，避免了酶切法由于第二识别位点因素的存在发生的非特异性切割。但是自我剪切法在诱导剪切时需加巯基试剂，会影响目标蛋白的二硫键。

以上4 种方法各有利弊，需要综合考虑目标蛋白的特性，以及标签移除方法和实验目的，选择合适的方法。

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