摘要：本应用简报介绍了用于分析烟草中农药残留的多组分分析方法的开发与优化。该方法包括使用 Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取试剂盒进行样品萃取，随后使用Agilent Captiva 增强型基质去除-低色素含量干性基质 (EMR-LPD) 进行通过式净化，然后进行 LC/MS/MS液质联用和 气质联用仪GC/MS/MS分析。新开发的方法在分析烟草中的大量农药时表现出高基质去除率和可接受的目标分析物定量结果，不合格率非常低。在烟草的分析中，300 多种适合 LC 和 GC 分析的农药获得了优异的方法定量结果，超过 95%的目标分析物平均回收率为 70%–120%，且超过 98% 的目标分析物平均 RSD 低于20%。通过干燥残渣重量进行基质去除评估，结果表明，烟草粉共萃取物的去除率约为 60%。通过式净化被证明是一种省时省力的简单方法。
前言烟草是一种重要经济作物，消费范围遍及全球。种植者为了保持作物质量和产量，会在种植、储存和运输过程中施用农药防治病虫害。公众因消费烟草而暴露于农药的问题已经在全球范围内引起高度关注。因此，监测烟草中的农药残留需要采用可靠的分析方法进行安全性评估，以符合 CORESTA 规定的指导性残留量 (GRLs)[1]。烟草是一种复杂的干性基质，含有多种成分，包括碳水化合物、蛋白质、脂肪酸、蜡质、色素、生物碱和尼古丁[2,3]。复杂的基质使样品前处理难以同时实现多组分农药萃取和基质去除。常用的样品前处理方法包括使用 QuEChERS 或改进QuEChERS 萃取，随后进行分散式 SPE 净化[4,6]。配备 Carbon S 小柱的 Captiva EMR 采用通过式净化方法进行快速高效的样品基质去除。Captiva EMR-普通色素干性基质(EMR-GPD) 和 EMR-低浓度色素干性基质 (EMR-LPD) 小柱尤其适用于复杂的植物干性基质。两种小柱均包含安捷伦吸附剂 Carbon S 和 Captiva EMR-Lipid，并以优化的配方与N-丙基乙二胺 (PSA) 和 C18 混合。Captiva EMR-Lipid 吸附剂可提供高选择性和高效脂质去除，而 PSA 吸附剂则可高效去除脂肪酸和其他酸，Carbon S 吸附剂可高效去除色素，EC-C18 可进一步净化疏水基质。混合配方经过精心开发和优化，为具有不同水平色素成分的复杂干性基质提供了更出色的基质去除率与目标分析物回收率之间的平衡。对于普通色素干性基质，通常推荐使用 Captiva EMR-GPD，而对于低浓度色素干性基质，则建议使用 Captiva EMR-LPD。本研究开发出一种在 QuEChERS 萃取后使用 Captiva EMR-LPD通过式净化的样品前处理方法，用于对烟草中的 300 多种常见农药进行 LC/MS/MS 和 GC/MS/MS 分析。还对该新型净化方法与传统的分散式 SPE (dSPE) 净化进行了全面比较。
实验部分化学品与试剂农药标准品和内标 (IS) 以混标储备液的形式购自安捷伦科技公司（货号 5190-0551）和 Restek (Bellefonte, PA, U.S.A.)，或以单标储备液或粉末的形式购自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO,U.S.A.)。HPLC 级乙腈 (ACN) 购自 Honeywell (Muskegon, MI,U.S.A.)。试剂级乙酸、乙酸铵和氟化铵也购自 Sigma-Aldrich。溶液与标准品用 1:1 ACN/水或 ACN 配制浓度为 10 µg/mL 的标样加标溶液（包括 LC 和 GC 标样加标溶液）和 IS 加标溶液，并在 -20 °C的冰箱中保存。标样和 IS 加标溶液使用前在室温下解冻并涡旋，使用后重新放回原处储存。在 990 mL 乙腈中加入 10 mL 冰乙酸，制备含 1% 乙酸的乙腈萃取溶剂，并于室温下储存。
仪器与材料LC/MS/MS 研究使用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱与 Agilent6490 三重四极杆 LC/MS 的联用系统。1290 Infinity 液相色谱系统包括 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290Infinity 自动进样器 (G4226A) 和 Agilent 1290 Infinity 柱温箱(G1316C)。联用的 6490 三重四极杆 LC/MS 配备安捷伦喷射流电喷雾离子源。采用 Agilent MassHunter Workstation 软件进行数据采集和分析。GC/MS/MS 研究使用 Agilent 8890 GC 与 Agilent 7000E 三重四极杆 GC/MS 系统 (GC/TQ)。GC 配置有 Agilent 7693A 自动液体进样器 (ALS) 和 150 个瓶位的样品盘。系统使用多模式进样口 (MMI)。使用由安捷伦吹扫 Ultimate 接头 (PUU) 连接的两根相同的 15 m 柱实现柱中反吹配置，并由 Agilent 8890 气路反吹模块 (PSD) 控制。有关 GC/TQ 配置，请参见 Andrianova 撰写的安捷伦应用简报[7]。在动态 MRM (dMRM) 模式下采集数据。采集方法为保留时间锁定法，以匹配 Agilent MassHunter农药与环境污染物 MRM 数据库 (P&EP 4) 中的保留时间，该数据库用于无缝创建 MS 方法。采用 MassHunter Workstation软件进行数据采集和分析。
样品前处理中使用的其他仪器包括：Centra CL3R 离心机(Thermo IEC, MA, U.S.A.)、Geno/Grinder (SPEX, NJ, U.S.A.)、Multi Reax 试管振荡器 (Heidolph, Schwabach, Germany)、移液管和重复用移液器 (Eppendorf, NY, U.S.A.)、安捷伦正压48 孔处理装置 (PPM-48)（货号 5191-4101）、Agilent BondElut QuEChERS EN 萃取试剂盒（货号 5982-5650）、AgilentCaptiva EMR-LPD 小柱，6 mL（货号 5610-2092）、AgilentBond Elut QuEChERS EMR-Lipid 除脂萃取盐包、3.5 g 无水MgSO4（货号 5982-0102）以及陶瓷均质子，50 mL 管，100/包（货号 5982-9313）。
仪器条件表 1 列出了 LC/MS/MS 条件。有关目标分析物的动态多反应监测 (dMRM) 参数，请参见 Zhao 的应用简报[8]。表 2 列出了GC/MS/MS 条件。有关目标分析物的 dMRM 参数，请参见Agilent MassHunter 农药与环境污染物 MRM 数据库 (P&EP 4)（部件号 G9250AA）。图 1 显示了采用 QuEChERS EN 萃取，然后用 Captiva EMR-LPD净化制备的浓度为 100 ng/g 的加标烟草粉样品中目标农药的典型 MRM 色谱图。
样品前处理烟草购自当地市场，将烟叶碎片取出并研磨成粉末。称取 1 g烟草粉置于 50 mL 离心管中。向每份样品中加入 5 mL 水。然后将样品涡旋 20 分钟，对干性基质进行充分水化和平衡。按照 QuEChERS EN 方法对样品混合物进行萃取。使用 CaptivaEMR-LPD 6 mL 小柱净化粗提物，并用无水 MgSO4 干燥。仅当使用 GC 检测以及联合 LC 和 GC 检测时，才需要干燥步骤。当仅使用 LC 检测时，可以省去干燥步骤。最终的样品洗脱液可以直接进样或进一步用水或缓冲液稀释。然后样品可直接进样至 GC/MS/MS，或在 LC/MS/MS 检测之前进一步稀释。详细的样品前处理流程如图 2 所示。从烟草粉中目标分析物浓度到最终经样品萃取和基质净化的烟草粉提取物，整个样品前处理过程的稀释倍数为 10 倍。
方法性能评估根据以下几个方面对开发的样品前处理方法进行了评估：烟草粉中的基质去除率，目标分析物回收率、重现性和基质效应，基质匹配校准曲线线性和定量限 (LOQs)。为评估回收率、重现性和基质效应，使用烟草粉制备 20 ng/g 和 100 ng/g 的预加标质量控制 (PR-QC) 样品，一式六份，对应的萃取后样品粗提物中的浓度为 2 ng/mL 和 10 ng/mL。然后使用开发的方法制备加标样品和基质空白样品。在用水稀释之前，在基质空白萃取物中制备后加标 QCs (PO-QC)，对应于 2 ng/mL 和10 ng/mL。以 2 ng/mL 和 10 ng/mL 的浓度直接对试剂空白（含 1% 乙酸的乙腈）加标，制备溶剂标样，然后用水适当稀释。每种 QC 平行制备 6 份。使用 PR-QCs 和 PO-QCs 中相应
目标分析物的峰面积比计算目标分析物回收率。使用 PR-QCs中的峰面积通过计算 RSD 确定样品前处理方法的重现性。使用 PO-QCs 和溶剂标样中相应目标物的峰面积比计算目标物基质效应。通过在烟草粉基质空白提取物中以 1、2、5、10、50、100、250、400 和 500 ng/g 的浓度进行后加标（在烟草中对应的浓度为 10–5000 ng/g），对基质匹配校准曲线线性和 LOQs 进行评估。由保留时间和 MRM 离子对确定分析物鉴定、确认和定量结果。
结果与讨论方法开发与优化烟草叶粉呈黄色至浅棕色。QuEChERS 萃取后的粗提物呈浅黄色，因此 Captiva EMR-LPD 是一个合适的选择。研磨后的烟草粉非常干燥，因此每 1 g 干粉需要加入 5 mL 水性缓冲液，然后通过涡旋进行较长时间的混合（20–30 分钟）。由此得到水化的均质物。
