3型固有淋巴细胞（ILC3）是肠道免疫领域的关键参与者，在肠道淋巴组织发育、屏障完整性、耐受菌群和饮食抗原等方面发挥关键作用。ILC3 对周围的微环境高度敏感。越来越多的研究已经确定了ILC3和肠道上皮之间的许多信号模块，这些模块在各种稳态和炎症过程中都很重要。这些研究都集中在ILC3信号对上皮细胞的影响上，其中白细胞介素-22（IL-22）在上皮细胞的多效性、环境依赖性和亚群特异性调控中处于中心位置。然而，ILC3 可以产生其他细胞因子和信号因子，可能与 IL-22 协同调节上皮细胞。此外，上皮-ILC3信号模块也可能是双向的，如上皮-ILC3相互作用在炎症性疾病（如炎症性肠病IBD）中的变化。
为了探索 ILC3-上皮肠道的相互作用，伦敦国王学院宿主-微生物相互作用中心、曼彻斯特大学生物医学与健康学院及瑞典哥德堡大学医学生物化学和细胞生物学系的研究团队在小鼠上皮小肠类器官（SIO）和小肠固有层（SILP）衍生的 ILC3 之间采用了体外共培养系统，用于描述 ILC3 衍生的 IL-22 对肠上皮细胞再生的影响并验证与神经肽激活的 ILC3 共培养后肠上皮细胞中 IL-22 靶基因的上调。该研究旨在确定 ILC3 和肠道上皮之间的新信号转导模块，并表征这些通路对上皮和 ILC 区室的影响。研究成果发表在 Mucosal Immunology 期刊题为“Bi-directional signaling between the intestinal epithelium and type-3 innate lymphoid cells regulates secretory dynamics and interleukin-22”。
首先，为了辨别 ILC3 对上皮表型的影响，使用 ILC3 的异质亚群（包括 CCR6- NKp46+/- 亚群和 CCR6+ LTi 样细胞）建立 SIO 共培养，以创建 ILC3 区室的代表性模型，比较了从SIO中分离出的肠上皮细胞（IEC）与ILC3共培养（IEC + ILC3）与在相同培养条件下不添加ILC3（IEC ONLY）的IEC的转录组。GSEA分析显示 IEC + ILC3 中分泌型杯状细胞和潘氏细胞特征显著富集，几种典型杯状细胞（例如 Spedf、Muc3、Muc2）和潘氏细胞（Defa23、Mmp7、Lyz）标志物的表达增加。这些数据表明，ILC3 促进了 SIO 模型系统中某些分泌型肠上皮特征的富集。
然后，实验试图表征这些分泌细胞如何影响共培养中的 ILC3 （图1 A），生成了富含潘氏细胞（PAN）和杯状细胞（GOB）的SIO方案。NCR+ ILC3 亚群是 IL-22 的重要生产者，且肠黏膜中IL-22 + ILC3减少与IBD的发生相关。与GOB共培养后，观察到与SIO或PAN共培养相比，NKp46+ ILC3的比例显著增加（图1 B、C）。与 SIO 相比，GOB 共培养后 ILC3 中 NKp46 的表达更高（图1 D）。然后将 NKp46- 和 NKP46+ ILC3 分别接种到 SIO 或 GOB 共培养物中，发现与传统的SIO共培养相比，GOB仅增加了NKp46- ILC3共培养物中NKp46+ ILC3的比例，而没有增加NKp46 + ILC3 中的比例（图1 E）。这表明，GOB促进NKp46low 或 NKp46- ILC3中NKp46的表达。
鉴于 GOB 在共培养中维持 NKp46+ ILC3 比例的强大能力，因此表征杯状细胞是否影响 ILC3 细胞因子谱。与 IL-22 结合时，ILC3 以亚群和刺激依赖性方式产生 IL-17 和 IFNγ。在非极化刺激条件下，与SIO共培养相比，GOB增加了IL-22+ 的比例，但没有增加IL-17+ 或IFNγ+ ILC3（图1 F-H），且IL-22在与GOB共培养的ILC3中表达增加（图1 G）。
然后评估了杯状细胞诱导的IL-22对上皮细胞的可能反馈。与SIO相比，与GOB共培养的ILC3中Il22转录物增加。同时，从 ILC3 共培养物中分离的 SIO 和 GOB IEC 中 IL-22 靶基因 Reg3g 的表达更高，且在受刺激的 GOB-ILC3 共培养中，Reg3g 在 IEC 中的表达最高（图1 I）。这些结果表明，杯状细胞维持NKp46+ 的表达并促进IL-22的产生，从而反馈上调上皮保护屏障成分。
为了确定杯状细胞对 ILC3 表型的调控是否由可溶性因子介导，在物理分离类器官和 ILC3 的transwell 系统中建立了共培养（图1 J）。与基质共培养相比，SIO 和 GOB 共培养中 ILC3 的 IL-22 表达降低（图1 K），表明物理接触在上皮介导的ILC3衍生的IL-22调节中的重要性。通过来自mCherry-MUC2小鼠的 RORγtGFP ILC3和SIO 共培养的实时成像，检测到ILC3和Muc2+ 细胞的共定位（图1 L）。这些数据表明，ILC3 可能在体内与杯状细胞发生物理相互作用。
图1 与富含SIO的杯状细胞（GOB）共培养维持NKp46的表达，并增加ILC3中IL-22的产生。
由于Notch信号依赖于物理相互作用，实验假设系统中ILC3的上皮调节是由Notch通路驱动的。Met分析证实杯状细胞富集 Notch 配体 Delta-Like-Canonical-Notch-Ligand （Dll）1 和 Dll4 （图2 A-C）。与常规 SIO 相比，GOB 中 Dll1 和 Dll4 的表达增加 （图2 D-F），Dll1 在 GOB 中富集，但未在 PAN中富集，这为 PAN 和 GOB 共培养中 IL-22 上调的差异提供了潜在机制（图1 B-D）。
接下来，为了验证杯状细胞衍生的Notch配体在调节ILC3衍生的IL-22中的重要性，在共培养前将GOB中Dll敲低（图2 G），发现GOB中Dll1+ IEC的比例和Dll1蛋白表达的折叠变化降低（图2 H-J），重要的是，从这些培养物中分离的 ILC3 的 Il22 表达显著降低（图2 K）。这些数据表明，上皮细胞，特别是杯状细胞，是肠道中Notch配体的来源，以调节ILC3。
转录因子 T-bet 是 NKp46+ ILC3 亚群的发育和维持所必需的，虽然尚未确定，但Notch和T-bet在调节NCR+ ILC3方面存在交集。为了确定 T-bet 在Notch1介导的GOB上调IL-22中的作用，分析Notch1受体激活后产生的裂解的Notch1胞内结构域（NICD），量化了Notch1活性信号。结果表明，与GOB共培养时，T-bet+ ILC3中NICD+ IL-22+ 双阳性细胞的增加，但在T-bet+ ILC3中没有增加（图2 L-M）。通过GOB共培养，IL-22的蛋白表达和裂解的NICD丰度在T-bet+ ILC3中特异性增加（图2 N-O）。这些结果强调了Notch通路在调节ILC3功能中的关键亚群特异性作用，其中T-bet+ ILC3亚群对杯状细胞衍生的Notch信号敏感，并通过IL-22 的生成作出响应（图2 P）。
图2 杯状细胞富集SIO （GOB）衍生的Notch配体Dll1在调节T-bet+ ILC3中起重要作用。
最后，研究人员考虑了 Notch 介导的 ILC3 和上皮细胞之间的相互作用对最初在转录数据集中观察到的分泌型细胞偏向分化的可能贡献。Notch信号对肠上皮中分泌细胞和吸收细胞谱系的发育很重要，Notch的失活可抑制转录因子Atoh1。对小鼠 Atoh1 靶组的GSVA显示，IEC + ILC3 中 Atoh1 和 Atoh1 靶基因显著富集（图3 A-C），在没有 ILC3 的情况下将 IL-22 补充到类器官培养物中未发现相同程度的特征。用 10 ng/ml IL-22 处理 SIO 24 小时后，未发现 Atoh1、Muc2、Tff3 或Lyz1 的 RT-qPCR 上调，但Fut2 和 Reg3g 上调（图3 D）。这与最近使用细胞因子添加到SIO来描述杯状细胞对IL-13和IL-22的二元反应的发现是一致的。因此，实验假设了一种机制，即 ILC3 可能通过结合祖细胞上皮群体中的 Notch 配体来调节控制分泌型与吸收型分化（图3 E）。
图3 ILC3上调Notch介导的分泌谱系转录因子Atoh1的上皮转录特征。
图4 图形概要
总之，该研究报告，ILC3 诱导肠上皮细胞的全局转录变化，驱动分泌型杯状细胞特征的富集。研究发现富含杯状细胞的 SIO 促进 NKp46+ ILC3 和 IL-22 的表达，这可以反馈诱导 IL-22 介导的上皮转录特征。然而，该系统中 ILC3 的上皮调节是接触依赖性的，并证明了上皮 Delta 样典型Notch-配体（Dll）通过亚群特异性 Notch1 介导的 T-bet+ ILC3 激活，在驱动 ILC3 产生 IL-22 中的作用。最后，在SIO-ILC3共培养中通过干扰Notch配体-受体动力学，ILC3似乎上调上皮Atoh1，从而影响分泌谱系决定。研究概述了肠上皮和ILC3之间的两个互补的双向信号模块，它们可能与肠道稳态和疾病有关。此外，该研究结果进一步证明了类器官是研究上皮免疫相互作用的有力工具。该系统提供的精细实验控制量可以继续发展我们对上皮-ILC 相互作用的详细理解，以概述可能支持肠道稳态并在临床相关疾病中失调的机制。
参考文献：Read E, Peña-Cearra A, Coman D, Jowett GM, Chung MWH, Coales I, Syntaka S, Finlay RE, Tachó-Piñot R, van Der Post S, Naizi U, Roberts LB, Hepworth MR, Curtis MA, Neves JF. Bi-directional signaling between the intestinal epithelium and type-3 innate lymphoid cells regulates secretory dynamics and interleukin-22. Mucosal Immunol. 2024 Feb;17(1):1-12. doi: 10.1016/j.mucimm.2023.11.002. Epub 2023 Nov 10. PMID: 37952849; PMCID: PMC7615753.
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Online ISSN: 1935-3456Linking ISSN: 1933-0219
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