蛋白质的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）极大地扩展了蛋白质组的多样性，对蛋白质的生物学功能至关重要。常见的PTM类型包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化等。
在进行PTM结构和功能研究时，通常需要获得均一且在特定位点有修饰的蛋白，而这往往是该研究领域的难点。其原因有：
1. 许多在大规模筛选中发现的修饰，其体内进行修饰的天然酶是未知的。
2. 天然酶可操控性低，有些修饰酶的底物特异性较广泛，无法在特定位点获得所需的PTM而不影响其他位点；而有些修饰酶的底物特异性相对严格，无法在天然位点以外的位置进行PTM。
非天然氨基酸选择性引入PTM
那么，能否不依赖天然酶直接合成具有所需PTM的蛋白质呢？通过在蛋白质中插入非天然氨基酸（nnAA或ncAA），即可实现将感兴趣的PTM选择性地引入目标蛋白质的任意位点。
图1 通过遗传密码扩展在蛋白质中插入非天然氨基酸[1]
通过插入nnAA引入位点特异性PTM主要有三种方法：
①直接掺入包含目标修饰的 nnAA。目标蛋白质合成后，即具备所需的PTM。
②掺入包含掩蔽PTM的nnAA。翻译后，可以用（光）化学方法去除掩蔽基团，所得蛋白质即可用于后续研究。
③掺入包含化学手柄的nnAA，该手柄可通过后续的生物共轭反应引入所需的PTM[1]。
图2 通过插入各种非天然氨基酸引入PTM[1]
非天然氨基酸引入磷酸化修饰案例
磷酸化是磷酸基团与蛋白质的可逆连接，是自然界中最重要的翻译后修饰（PTM）之一，是蛋白质功能和分子识别多样化的机制。Javin等人[2]利用无细胞蛋白表达系统（CFPS），通过在特异位点引入磷酸化丝氨酸（Sep）成功表达了有活性的人类MEK1激酶，评估了单磷酸化和双磷酸化形式的位点特异性磷酸化对MEK1活性的贡献。
首先，研究人员利用来源于大肠杆菌的细胞提取物构建了无细胞表达系统（CFPS）。该大肠杆菌菌株为释放因子1（RF1）与磷酸丝氨酸特异性磷酸酶（SerB）的缺陷型菌株，且生长过程中表达了磷酸丝氨酸的正交翻译系统（Sep-OTS），因此所构建的CFPS体系富含磷蛋白合成所必需的OTS成分（即磷酸丝氨酸-tRNA合成酶、tRNASep和 EF-Sep）。
图3 通过CFPS引入Sep合成磷蛋白[2]
随后，研究人员利用该CFPS系统在20小时内表达了在S218和S222位置为丝氨酸的野生型MEK1（MEK1-SS）、在S218或S222处单位点磷酸化的MEK1变体（MEK1-SPS、MEK1-SSP）、以及双磷酸化的MEK1变体（MEK1-SPSP）。成功表达不同形式的MEK1后，研究人员通过WB分析验证了全长MEK1及各种变体的产生；通过Phos-Tag凝胶移位分析验证了Sep的存在，并清楚地证明了MEK1的单位点和双位点磷酸化。最后研究人员通过体外激酶级联试验探究了CFPS的单磷酸化和双磷酸化MEK1变体对ERK2的酶活性。
图4 磷酸化MEK1变体的体外合成[2]
该研究通过CFPS系统引入磷酸化表达MEK1之处在于：第一，CFPS系统规避了nnAA跨膜运输，该研究中MEK1突变体表达量远高于细胞内表达（0.001 mg/mL）[3]；第二，本研究通过CFPS系统可以在没有融合伴侣的情况下表达MEK1，不产生可溶性蛋白伴侣的混杂影响。第三，通过在特异位点引入Sep能够产生单磷酸化形式的激酶，而无需添加丙氨酸突变来抑制第二位点的磷酸化。
CFPS的非天然氨基酸插入天赋
无细胞蛋白表达（CFPS）是将细胞内合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖体及转录翻译辅助因子等分子机器提取出来，并辅以核苷酸、氨基酸、能量物质及基因模板而在没有活细胞参与的体外直接合成蛋白质的生物反应。
CFPS在非天然氨基酸插入领域具有显著优势：
（1）无细胞系统没有细胞膜阻碍，规避了nnAAs跨膜运输的难点；
（2）无细胞系统不受nnAAs以及目标非天然蛋白可能产生的细胞毒性作用影响；
（3）有利于消除nnAAs插入的内源性竞争，提高nnAAs插入效率。
参考文献：
[1]NIU W, GUO J. Co-translational Installation of Posttranslational Modifications by Non-canonical Amino Acid Mutagenesis. ChemBioChem, 2023, 24(9).
[2]OZA J P, AERNI H R, PIRMAN N L, 等. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications, 2015, 6.
[3]Park, H.-S., 等. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science, 2011, 333.
