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2024/10/25 18:08:05脑类器官使得人类大脑发育的机制研究成为可能,并提供了在不受限制的发育系统中探索自我组织形成的机会,类器官的成像观察是理解其微观结构和功能的重要手段(文献1)。由于人脑类器官的尺寸较大,组织致密,发育缓慢,且在几周到几个月的发育过程中需要无菌成像条件,使得对人脑类器官的活体成像特别是长时间,面临巨大挑战。
在本例中,作者建立了长期的活体光片显微镜技术,应用于由荧光标记的人类诱导多能干细胞生成的无指导脑类器官,这使得我们能够在类器官发育的数周内跟踪组织形态、细胞行为和亚细胞特征,为研究人类大脑形态动力学提供了新的途径,并支持基质相关的机械感知动态在大脑区域化过程中发挥核心作用的观点。
稀疏和多位点荧光标记脑类器官的
长期活体成像
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外源性细胞外基质影响大脑类
器官的形态发生
为了量化类器官之间的形态动态变化,作者利Viventis LS2光片显微镜低光毒性、多位点、多视角的成像能力,一次成像并行记录16个类器官通过统计分析不同时间点类器官体积、腔室体积和腔室数量,结果突出了早期大脑类器官发育的三个形态动力学阶段,包括:
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快速组织和腔体生长的早期阶段
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涉及腔体融合事件的组织稳定阶段
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神经上皮成熟的最终阶段
对比用基质胶、低熔点琼脂糖和不使用任何外源基质培养类器官,使用光片长时间跟踪类器官动力学,结果显示外源细胞外基质的存在对人脑类器官的组织尺度形态发生有重大影响,且改变的组织极性可能会影响成熟神经上皮中的细胞形态动力学。
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单细胞形态类型分析揭示了发育中的
类器官内形状的转变
研究人员利用多位点标记的质膜、肌动蛋白、微管、核膜和组蛋白评估细胞形态变化在早期大脑类器官发育过程中对细胞的影响。通过开发的图像分析流程:图像预处理→亚细胞结构分割→结构预测→特征提取→解多通道→形态特征分析,揭示了两个主要的核(组蛋白、层粘连蛋白)和细胞(肌动蛋白、微管、膜)结构组。
通过高分辨率聚类,将结构分组为形态类型,即具有相似形态特征(如体积、曲率、轴长的细胞簇,使用PAGA轨迹分析识别组织中的结构变化梯度,量化了多能干细胞向早期神经外胚层的过渡,基于细胞结构形态和组织拓扑变化形成成熟的神经上皮。
通过对每种基质条件(基质胶、琼脂糖和无外源基质)下,对每一天成像的类器官进行标记结构的分割以及形态学分类分析,结果表明在没有基质胶作为外部细胞外基质的情况下生成的类器官在组织拓扑上发生了变化,包含更大比例的非排列和非延长细胞,细胞形态类型的异质性更高,并且未形成均匀的神经外胚层和神经上皮。
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矩阵通过调节 WNT 通路影响类器官的
形态发生和模式形成
为了理解在不同基质条件(基质胶、琼脂糖、无矩阵)下生长的类器官中发展出的分子细胞状态,我们对第 13 天的类器官进行了单细胞转录组分析,差异表达基因的基因本体分析显示出多个信号通路的富集,包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信号通路以及与肌动蛋白细胞骨架调节相关的基因。
基质胶诱导的神经外胚层的强烈形态变化,以及在无基质条件下 WNT 和 Hippo 信号通路的上调,测试了YAP调节对类器官发育的影响。综合证实了我们应用含有外部基底膜丰富的 ECM 的 matrigel,导致腔体扩张并自我模式化为主要的头侧前脑区域,并且 YAP1 的激活和 WLS 表达水平的增加促进了发育中的神经上皮的尾部化。
在对人类早期脑类器官的形态动力学研究中,Viventis LS2 Live光片显微镜以极低的光毒性,通过多视角、多位置、长时程的活细胞成像,展现脑类器官的整个发育过程。在单次长时程成像过程中,同时收集多个样本在不同条件下的数据,结合自我开发的分析流程、单细胞转录组分析、信号通路探索分析,展示了YAP1 在基质介导的形态发生和类器官模式化中发挥的作用。
总的来说,这一应用案例为理解类器官发育的形态动力学提供了技术进步,提供了对基质介导的神经上皮信号通路的机制性见解,并为未来探索人类大脑发育过程中细胞外微环境铺平了道路。
参考文献:
1.Method of the Year 2017: Organoids. (2018). Nature Methods
2.Elke Gabriel et.al Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles Cell Stem Cell 28, 1740–1757, October 7, 2021
3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023
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