显微应用 | 癌症免疫学中的3D超多标成像（上）

在癌症免疫学研究中，评估组织变化和细胞相互作用对于识别特定细胞类型、评估免疫细胞活化状态、监测特定蛋白质和/或基因标记物的表达以及表征肿瘤微环境至关重要。不同样本之间的参数变化（例如健康与病变、治疗与未治疗）通常非常复杂，并且发生在三维环境中。

肿瘤细胞与其微环境的相互作用在很大程度上决定了某种类型癌症的特征，因此成像策略是研究肿瘤组织的自然选择。现代成像技术与多种组学方法的结合在空间生物学这一新兴领域中发挥了关键作用。来自基因组学、 蛋白质组学和代谢组学的信息，与结构和空间-功能关系结合，可以提供其他方法难以获得的洞见。

上述过程由分子和细胞之间复杂的相互作用驱动。因此，使用荧光成像研究这些过程的实验设计需要能够区分和定位大量标记物，由抗体识别并与合适染料结合的靶抗原。

常见的成像一组标记物的方法（即“面板”）包括每次最多4个标记的依次染色/成像/去染步骤，随后对图像进行校准并重新定位样品。

理论上，通过不断迭代，可以成像无限数量的标记物，然而在实际操作中，随着多标记数量的提高，这变得更加困难。此外，只有在实验结束后，即最后一次染色/成像/去染以及多图像叠加完成后，才能看到所有标记的结果。

这一点尤为关键，因为在任何给定时刻只有少量标记物可见。成像策略无法改变，如果出现意外或新的情况，也无法返回感兴趣区域进行进一步探索或更改成像参数，因为样品已经不再相同。

多图像叠加增加了实验的复杂性，因为每轮成像都需要一个共同特征或标记，作为基准，使所有标记能够虚拟地组合在一起。一个广泛使用的策略是在每次迭代中用 DAPI染色作为锚点，牺牲一个成像通道来进行核染色。另一个限制在于染色/去染步骤的化学性操作，存在改变抗原和/或样品物理完整性的风险，从而降低多标记结果的质量。最后，3D信息的重建并非经典流程中的操作，由于样品重定位和循环染色导致的变形，使得这一步变得极其困难。

单次成像方法提供了强大的优势，可以克服超多标应用的一些挑战。

由于所有多标信息同时获取，研究人员可以探索和调整成像策略，保护样品免受严苛的去染处理，并直接在3D中获得数据的结果，带来额外维度的信息丰富性。

在此，我们通过对小鼠肿瘤组织进行的单次3D 15标（即15种标记物）实验展示了这种方法的潜力（图1a）。

选择15种标记物使得科研工作者能够对该组织中的一组免疫细胞、癌症特征和结构标志物进行功能描述。

样品准备过程中，将小鼠胰腺导管腺癌细胞（KPC-4662）皮下注射到C57Bl/6小鼠体内，并允许其生长3周。然后取出肿瘤，固定并制备厚度为70微米的切片并进行染色。

使用STELLARIS共聚焦显微镜进行成像，该显微镜配备了名为SpectraPlex的新功能，专门为超多标成像方法提供一组工具。共聚焦功能不仅可以获取薄组织切片的大视野图像（如宽场的迭代成像方法），还可以在整个z范围内生成3D 图像。高分辨率的3D数据支持空间分布模式的全面探索。

利用SpectraPlex，该15标实验的步骤由“标记面板”引导。这些标记物通过在软件中定义生物目标和染料的组合来实现，并可添加到一个名为“虚拟冰箱”的数据库中。数据库中存储了实验室中常用或自创建的标记物。

将相关的标记物从虚拟冰箱中移动到专用工具中，即可创建面板通过实时计算，面板为显微镜采集设置提供建议。这为仪器的后续交互操作提供实验控制的指导，而手动优化选项则为经验丰富的用户提供了灵活性。

在此示例中，基于先前经验和商业染料设计确定了特定的目标-染料组合。我们利用了整个激发光谱范围 （405nm及440–790nm）和荧光发射光谱（高达850nm）（图1b）。

Spectra Plex

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