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显微应用 | 癌症免疫学中的3D超多标成像（上）
癌症免疫学中的3D多标记成像可更好地表征组织变化和细胞相互作用。本文介绍了一种在STELLARIS 共聚焦平台上进行3D成像的单次、超多标工作流程，用于小鼠肿瘤组织成像。通过优化成像设置和先进的拆分技术，我们准确地拆分了来自15种标记物的信号，实现了细胞类型和功能状态的精确识别。这种方法为癌症研究提供了全面的工具，有助于深入理解肿瘤微环境。
在成像时保持染料的光谱重叠尽可能低至关重要，但在如此高密度的多标记样本中，串色无法wanquan避免。
在这种超多标水平上，拆分工具提供了一种识别和量化每个标记物贡献的方法。
传统方法中，单独染色一个样本（每个标记物一个）作为拆分的对照和起点。对照样本中获取的信息用于构建拆分矩阵。单染色方法比较繁琐，因为这需要大量的样本和精力，来创建与多重标记数量相同数量的样本。
图2：超多标实验中创建对照数据的新策略。a–c,肿瘤对照样品（顶部）分别对5种不同标记物进行了部分染色，创建了3组标记子集，以最小化串色可能的前提下涵盖所需的15种染料对照（中间）。在成像工作流程中，对每组部分染色的样本进行全通道采集（目标图像，底部），这些图像用于生成15标拆分矩阵。
由于样本通常稀缺且难以获得， SpectraPlex提供了一种便利的节省样本的替代方案：不用准备一组单独的单染色样本，用户会得到一组含有染料子集的对照样本的制备建议。在我们的示例中，我们创建了一套三个组织切片，每个切片分别染色15标面板中的5个标记（即“Group”方法；图2a–c，上方），并使用工作流程建议的设置进行成像。结果显示出无串色的5通道模板，可构建拆分矩阵（图2a–c，中间）。第二步，我们在同一视野内使用推荐设置对完整的15标通道进行成像（图2a–c，下方）。这两步的信息用于创建整体拆分矩阵。
图3：小鼠胰腺肿瘤切片的3D 15标成像。a, 使用SpectraPlex功能对染色并拆分后的肿瘤切片进行成像的概览。比例尺：500 µm。b–g, 从15标中提取的成像通道中的生物靶标细节，以便于展示。比例尺：50 µm。b, 淋巴细胞：B220（薄荷绿色）、CD4（青色）和CD8（黄色）。c, T细胞及抗原，解析其功能状态：CD4（青色）、CD8（黄色）、PD1（紫色）、FoxP3（白色）和TCF1（棕褐色）。d, 髓系细胞：CD11b（天蓝色）、CD11c（红色）和MHC II（棕色）。e, 增殖细胞和基质抗原：Ki67 （深蓝色）、α-SMA（橙色）和Tenascin C（森林绿色）。f, 癌上皮细胞和基质细胞功能状态：E-钙 黏蛋白（玫瑰色）和MHC I（绿色）。周围的细胞外基质：Tenascin C（森林绿色）。g, 增殖细胞和成纤维细胞：Ki67（深蓝色）和α-SMA（橙色）。血管内皮细胞：CD31（柑橘绿色）。
计算出拆分矩阵后，使用相应的设置对完整的15标样本进行采集。拆分后的数据会自动生成（图 3），并附上对应的原始图像，方便后续分析和解释。带有所有生物相关通道的样本片段展示了单轮染色方法的丰富信息（图3a）。
癌症样本的详细视图展示了不同的微环境。例如，富含淋巴细胞的区域（B 和T细胞）展示了免疫系统在肿瘤中已经开始执行功能（图3b）。这些淋巴细胞大多具备免疫功能，直接或间接抵抗肿瘤生长（图3c中TCF1和PD1的表达），其中部分细胞还具有调节作用（图3c中FoxP3的 表达）。髓系细胞在肿瘤中通常更为常见，功能各异，可发挥抗肿瘤或促肿瘤作用，其空间分布在很小尺度上呈现显著差异（图3d）。
样本中的癌症、基质和细胞外基质标记物表现出较高的异质性。虽然这些标记物的分布较为复杂（例如，成纤维细胞的细胞过程），但它们也明显覆盖了大片上皮和内皮细胞区域（图3e–g）。高级拆分程序确保在组织内准确识别不同的细胞类型及其功能状态（例如，免疫细胞亚型、组织决定因子和疾病决定因子）。
总体而言，建立一种稳健、快速且灵活的3D成像方法以评估癌症组织对于解析肿瘤微环境的变化至关重要。该成像工作流程的高效性可以加速结果评估、决策制定，并为后续实验设计提供有力支持。
一次性成像方法为此工作流程带来了两项关键优势。首先，能够对与癌症标记物相关的感兴趣区域（ROIs）进行深入探索，例如在不同放大倍数和更高分辨率下进行更详细的空间特征分析。其次，所有标记物在三维环境中同时存在，确保在组织中发现的相互作用置于其预期或意料之外的组织微环境中进行分析。
总结
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本研究展示了15种标记方法的成功应用，并为推动癌症研究提供了重要的工具，能够更好地表征肿瘤微环境中的免疫细胞类型和亚型、癌症组织的免疫响应以及对潜在治疗的反应。
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