利用短波红外拉曼散射实现宏观无标记的生物医学成像

本文要点：短波红外 （SWIR） 成像可在临床和临床前应用中增强生物组织穿透深度并减少自发荧光。然而，现有应用通常无法在没有造影剂的情况下探测化学成分和分子特异性的能力。作者提出了一种 SWIR 成像方法，该方法可以在大视场中可视化组织深处的自发拉曼散射，并表现出明显的化学对比度。本文的结果表明，拉曼散射有效地解决了自发荧光在短至 892 nm 的照明波长下造成内源性组织背景较高的问题。通过体内监测全身组织成分动力学和检测小鼠脂肪肝疾病，以及鉴定未固定的人动脉粥样硬化斑块中的钙化和脂质，展示了 SWIR 拉曼成像的多功能性。此外，该方法有助于可视化嵌入到脂肪组织中的神经，这是外科应用的重大进步。SWIR 拉曼成像采用与荧光正交的简单宽场设置，有望被临床医生和生物学家迅速采用。这项技术为全动物病理生理学的无造影剂可视化和人类术中成像开辟了新的可能性。

本文利用 SWIR 成像来实现大视野组织深处的自发拉曼散射可视化。通过使用 892 至 1064 nm 之间的照明波长，克服了以前生物组织自发拉曼成像中的自发荧光限制，并提供了优异的化学对比度。为了证明 SWIR 拉曼成像的强大功能，作者展示了其监测小鼠模型和人体组织中动态生理和病理组织重塑的能力。

图1. 宽视场宏观 SWIR 拉曼成像系统设计、体外验证和初步生物学演示

基于新启用的在大视场中可视化拉曼散射的能力，作者研究了完整小鼠体内生物组织的全身化学对比。脂肪组织脂肪库和位于胸骨下方的剑突软骨在 CH 区的完整皮肤中表现出强烈的对比度，而 OH 波段的信号分布在整个身体中（图 1 d ）。此外，皮下淋巴结和脂肪组织脂肪库根据它们的相对水分和脂质含量清晰可辨，由它们各自的 OH 和 CH 拉曼强度决定。这种化学对比与背景自发荧光明显不同。

此外，SWIR 拉曼成像能够通过人体皮肤实现化学对比的可视化。通过 CH 拉曼信号观察了手和手指背表面的皮下脂肪垫， OH 拉曼带则突出了伸肌腱和相邻的手背骨间肌（图 1 e-f ）。值得注意的是，在皮下血管下观察到脂肪垫和肌腱的拉曼对比，这产生了负对比，尤其是在 CH 区域。相比之下，自发荧光主要表现在皮肤表面的皱纹中。

图2. 在照明波长等于或高于 892 nm 的宽场成像中，拉曼散射是组织背景的主要来源

为了了解不同照明波长对组织化学对比度的影响并确定其优点和局限性，作者从完整小鼠身上获取了 SWIR 拉曼图像，照明波长从 785 nm（拉曼成像中常用的波长）到 1064 nm（红移波长，将拉曼散射波长延伸到标准 InGaAs 探测器的极限之外）。研究结果表明，一旦照明波长达到 892 nm，化学对比度（特别是脂肪组织脂肪库中 CH 区域的化学对比度）就会变得比自发荧光更强，并继续上升到 1064 nm（图 2 a-d）。即使使用长通滤光片在同一帧内捕获拉曼静默区域，这种基于拉曼的对比度增加也是显而易见的，突出表明，即使在非特定的宽成像带内，较长照明下化学对比度的增强也能有效克服自发荧光。然而，较长的波长需要较慢的成像帧速率，需要根据特定的应用要求平衡对比度和采集速度。

图3. 小鼠病理生理学中化学造影剂的体内 SWIR 拉曼成像

随后，作者探索了 SWIR 拉曼成像在临床前小鼠模型中全身水平身体成分非侵入性可视化的应用。最初，为了检测脂肪组织表型，对遗传性肥胖小鼠 （ob/ob） 进行了成像，由于缺乏饱腹感激素瘦素，与年龄匹配的对照相比，体重增加多达三倍。拉曼 CH 区域对比突出了他们全身脂肪组织脂肪库的丰度（图 3 a）。

接下来，作者评估了 SWIR 拉曼成像在肝脂肪变性化学造影剂检测中的潜力，对小鼠进行宏观 SWIR 拉曼成像。通过完整的皮肤，检测到喂食 MCD 饮食的小鼠肝脏中的拉曼 CH 强度高于喂食正常饮食的同窝小鼠（图 3 b-d）。这些发现证明了 SWIR 拉曼成像作为 MASLD 等疾病进展过程中组织成分变化的全身、监测的宝贵工具的潜力。

转向体内应用后，作者利用 SWIR 拉曼成像纵向监测活体小鼠的组织动力学，展示了其和无标记的特性。系统跟踪禁食的小鼠体内身体成分变化的能力，观察到禁食 24 小时后脂肪组织中散射的拉曼 CH 区强烈减少，这在再进食后 48 小时内逆转（图 3 e ）。

图4. SWIR 拉曼成像用于对小鼠和人类未固定样品中的组织成分进行离体分析

本文研究了 SWIR 拉曼光谱仪在测量未固定组织中脂质含量的应用，这将能够进行直接组织分析，同时保持其天然和完整的成分。事实上，作者在会诱导肥胖和肝脂肪变性的高脂肪饮食（图4）的野生型小鼠的肝脏中观察到更强的 CH 强度，表明脂质含量较高。

采用 SWIR 拉曼成像来可视化未固定的人类斑块中的异质组织成分。利用在外翻血栓动脉内膜切除术期间从患者获得的颈动脉或股动脉切除的动脉粥样硬化组织，靶向 PO4-3960 cm-1 处的拉曼峰检测动脉粥样硬化斑块钙化，CH 区检测脂质。值得注意的是，观察到斑块内显示钙化或大量脂质含量的不同结构域，无需进行组织处理，例如固定、脱钙、切片和染色（图 4 d-e）。通过比较采用固定和脱钙方案前后的成像结果来验证拉曼造影剂对钙化的特异性。该方案消除了 PO4-3信号并降低 CH 强度（图 4 f-g ）。

图5. 使用 SWIR 拉曼成像对猪手术模型脂肪组织的神经进行鉴定

虽然神经可以在视觉上与肌肉组织区分开来，但当它们嵌入脂肪组织中时，它们在可见光下的识别变得非常困难（图 5 a）。本文采用 SWIR 拉曼成像来可视化猪模型中的面神经。、结果显示，基于拉曼成像，脂肪组织内存在强烈的神经对比（图 5 b-c ）。最重要的是，SWIR 拉曼成像能够揭示在可见光下不可见的隐藏结构。尽管血管中存在可以肉眼识别的 OH 信号，但研究结果表明 SWIR 拉曼成像在术中环境中的潜力。通过利用无标记化学造影剂，它无需外源性造影剂即可实现神经等关键结构的可视化。

在这项工作中，作者推出了一种新颖的基于拉曼散射的成像方法，该方法能够在单帧中实现高化学对比度，而无需自发荧光减法或光谱解混，视野超过 50 cm2，实现新的生物医学应用.研究结果表明，当组织用 892 或更长的波长照射时，基于拉曼散射的化学对比克服了自发荧光。这表明宽场拉曼成像应利用这些波长来获得化学对比度，因此需要 SWIR 拉曼散射检测。除了自发荧光抑制之外，SWIR 拉曼成像还利用了该波长范围固有的光学优势，例如更深的组织穿透、更强的成像对比度和更高的分辨率。本研究的结果在 892 nm 照明下每帧 10 秒曝光内显示出明显的化学对比和高信噪比。采用目前正在开发的更大、更灵敏的 SWIR 探测器，将实现更高的信噪比和更短的曝光时间。

总之，SWIR 拉曼成像不仅将拉曼成像的应用扩展到宏观尺度，而且扩展了生物医学成像的整体能力。通过与传统荧光成像保持正交，这种简单的方法支持多模式策略，从而为临床前和临床应用开辟了新的途径。在手术环境中，它的使用有望通过实现关键结构（例如隐藏在脂肪组织中的神经）的可视化而带来的好处，从而解决当今接受手术的患者面临的主要风险。

参考文献

Arus B A, Yiu J, Lingg J G P, et al. Macroscopic label-free biomedical imaging with shortwave infrared Raman scattering[J]. bioRxiv, 2024: 2024.06. 10.597863.